前言
甘藍型油菜是中國一種重要的油料作物，在油菜育種工作中，開花期是一個重要的農藝性狀，適時開花直接影響到油菜的成熟時期，是保證產量穩定性的前提條件，油菜的開花期受溫度和光周期等因素影響。
其中光周期是植物開花調控的關鍵因素，不同年份間，同一季節變化不大，隨著生物技術的不斷發展以及阿拉伯芥中越來越多基因功能的挖掘，可以利用阿拉伯芥中的基因資訊對甘藍型油菜中的同源基因進行功能解析。
本研究根據與阿拉伯芥同源比對的結果挑選了BnaCO、BnaC3p7和BnaKHZI作為目的基因，CO是光周期途徑中重要的轉錄調控因子，C3HI7和KHZI是阿拉伯芥中CCH家族基因，這類家族在植物生長發育和逆境脅迫中有重要作用，分異位建這些基因的超表達載體轉化阿拉伯芥，以及構建多靶點CRISPR/Cas9載體轉化甘藍型油菜Westar品種，考察超表達株系和突變體後代表型。
甘藍型油菜開花期研究
甘藍型油菜屬於異源四倍體，跟模式植物阿拉伯芥相比，基因組更加復雜，基因功能研究也有一定的難度，對於甘藍型油菜開花期相關的研究，已有許多關於開花基因數量性狀位點的報道，隨著分子標記和測序技術的發展，利用連鎖分析和關聯分析，越來越多的開花基因OTL被挖掘。
早在1997年，Osbom等對甘藍型油菜、白菜和阿拉伯芥的分離群體的開花相關QTL,定位區間進行比較,檢測到2個OTL區段對應於阿拉伯芥含FLOWERNNGLOCUSC等開花基因的區段。
推測薈薹屬作物C和FRI等開花基因與阿拉伯芥的同源基因具有相似功能，Zhao等利用歐洲品種和中國自交系品種為親本構建DH群體以及SSR標記連鎖圖譜，對株高、開花期和成熟期共3個農藝性狀進行OTL分析。
找到25個與阿拉伯芥同源的開花候選基因，並且關聯最顯著的SNP位點位於阿拉伯芥CO同源基因附近，距離只有13Kb，同樣的，Wang等透過60KSNP芯片對448份甘藍型油菜材料在4個不同環境下進行開花時間的全基因組關聯分析。
發現40個開花時間顯著關聯位點，該研究進一步發現有20個開花期QT和224個開花期基因分別與24個和81個與生態型相關的區域重疊，揭示了甘藍型油菜開花時間變異的一些關聯標記性狀和候選基因。
在甘藍型油菜中鑒定出4個阿拉伯芥FRI同源基因，Yi等進行關聯分析發現，只有FRI參與了甘藍型油菜開花調控,包括該同源基因在內的3個同源基因含有大量的多型性位點進行單倍型分析發現這3個同源基因在冬油菜中具有單倍型分布。
該研究首次為Bna43_FRI調控甘藍型油菜開花提供分子基礎，Wu等對991份甘藍型油菜種質資源材料進行重測序，對FT和FLC的序列進行分析發現，同源基因的不同拷貝的編碼區序列在不同生態群中保守，而其啟動子區域多型性較為豐富。
2個基因在不同的生態型材料中表達水平有明顯差異，說明這2個基因啟動子區域的差異可能導致了不同生態型的開花差異，Chen等在甘藍型油菜的2個近等基因系群體中圖位複制了FLC的2個同源基因BnFLC.A2和BFLC.C2,發現在BFLC.A2中有一個2.833Kb的插入,導致其失活並透過同源交換匯入到C2染色體上，從而影響油菜的開花。
盡管基於關聯分析和連鎖分析鑒定到了大量開花期相關QTL，但由於甘藍型油菜基因組的復雜性和開花期性狀作為典型的數量性狀，目前甘藍型油菜開花相關基因複制存在一定難度，相關的報道並不多，阿拉伯芥與油菜親緣關系近，並且有共同的祖先。
因此利用同源複制的方法，從甘藍型油菜中複制同源基因是可行的，Robert等利用同源複制的方法，從甘藍型油菜中分離得到4個阿拉伯芥CO同源基因，其中BnCOa1與阿拉伯芥co-2突變體表型互補，Tadege等在甘藍型油菜中分離了5個阿拉伯芥同源FLC基因BnFLC1-5，轉化阿拉伯芥發現5個拷貝均能使阿拉伯芥晚開花3周以上。
阿拉伯芥CO基因的研究
CO基因是植物光周期途徑中一個重要的轉錄調控因子，在整個植物開花調控網絡中占有關鍵地位，關於阿拉伯芥CO基因的功能研究在很早之前就有報道。
最初的研究表明，CO僅在長日照條件下對阿拉伯芥開花有促進作用，在短日照下不參與開花調控，但近來有研究發現CO在短日照條件下能推遲阿拉伯芥開花。
在阿拉伯芥中，CO屬於COL(CO-Like)家族，在阿拉伯芥中還有其他16個基因成員，該家族基因編碼的蛋白質在N端附近有1個或2個B-box結構，在C端有1個CCT結構域，CCT結構域編碼約42-43個胺基酸，是非常重要的結構域。
CO的表達主要受光的2種方式調控，一是光受體直接調控CO的表達，二是光受體透過調控生物鐘相關基因間接調控CO的表達，光受體直接調控CO的表達主要可以影響CO蛋白的穩定性，繼而調控其表達規律，從而影響植物開花。
E3泛素連線酶,在長日照條件下,白天參與CO蛋白的降解，而藍光受體FKF1能夠抑制COP1從而保護CO蛋白不被降解，以此來調控開花，G!是生物鐘相關基因，是光周期途徑中另一重要基因，可調控CO基因的表達。
在傍晚，GI和FKF1蛋白復合物共同靶向降解Dof類轉錄因子，1個C0轉錄抑制蛋白，從而促進CO的表達，調控阿拉伯芥的開花，長日照條件下，CO基因在光受體和生物鐘相關基因的共同調控下，其表達量呈現節律性變化，並且COmRNA在傍晚和晚間出現高峰，而CO蛋白只在傍晚出現高峰，因為夜間有COP1和SPA1蛋白復合物進行降解。
CRISPR/Cas9相關研究
基因編輯技術是對基因組實作定點編輯的一項技術，是目前研究植物基因功能的一種理想手段，其原理是透過特異性核酸酶對目的DNA序列進行剪下，產生雙鏈斷裂,繼而以非同源末端連線或者同源重組的方式對靶位點進行修復。
在修復的過程中靶位點產生插入、缺失或者替換等突變，近年來，基因編輯技術發展迅速，而CRISPR/CaS9基因編輯技術因為便於操作、成本低和效率高等優點，被廣泛套用。
CRISPR/CIS系統一般存在於多數的細菌以及古生菌中，是機體形成的一種適應力免疫系統，可以降解外源入侵病毒從而保護自身不受侵害，其組成結構比較簡單，包括tracrRNA、Cas基因、前導序列以及CRISPR位點。
CRISPR位點包括高度保守的重復序列和能夠辨識外源DNA的特異間隔序列，與特異間隔序列對應的外源DNA序列通常稱為原間隔序列，一般在原間隔序列的3’端有幾個保守的堿基序列，稱為PAM元件，長度為2-5個堿基，在CRISPR/CaS9系統中，PAM序列為NGG，是剪下靶序列時的重要辨識位點。
CRISPR/CIs系統的免疫過程大致可分為3個部份:首先是CRISPR間隔序列的獲得，當噬菌體病毒或質體等外源DNA入侵宿主時，宿主細胞透過PAM元件的辨識，將外源基因組的原間隔序列整合到CRISPR位點上。
CRISPR基因座的表達，宿主的CRISPR序列經過前一個過程，整合了外源基因組的原間隔序列，然後在前導序列的調控下被轉錄成前體CRISPRRNA，之後在核酸內切酶的加工下，被剪下為成熟的crRNA。
最後是CRISPR/CaS系統介導的免疫，當同種外源DNA再次入侵宿主細胞時，cRNA能夠辨識外源基因組的原間隔序列，和Cas蛋白共同作用對其進行酶切裂解，從而保護自身細胞不受侵害。
CRISPR/Cas9突變類別及檢測方法
CRISPR/Cas9導致的突變類別主要有插入、缺失和堿基替換，主要發生在PAM上遊3bp處，這些突變類別中以單堿基插入為主，單堿基插入又以A或T堿基插入為主，還有單堿基到多堿基的插入或缺失，堿基替換概率最低。
影響CRISPR/Cas9編輯效率的因素有很多，Cas9基因密碼子的最佳化、Cas9基因的啟動子以及T-DNA插入植物基因組的位置都會影響Cas9的表達水平及活性，進而影響編輯效果。
其次還有靶位點的序列、GC含量、其與基因組可能形成的二級結構等也會影響編輯效果，還可能與植物材料本身有關，同一載體針對不同的植物材料可能編輯效果也會不一樣，假如植物的修復能力強，那麽突變效率可能就會降低。
影響CRISPR/Cas9編輯效率的因素有很多，Cas?基因密碼子的最佳化、Cas9基因的啟動子以及T-DNA插入植物基因組的位置都會影響Cas9的表達水平及活性，進而影響編輯效果。
其次還有靶位點的序列、GC含量、其與基因組可能形成的二級結構等也會影響編輯效果，還可能與植物材料本身有關，同一載體針對不同的植物材料可能編輯效果也會不一樣，假如植物的修復能力強，那麽突變效率可能就會降低。
目前經過改造的CRISPR/CaS9系統已被套用到許多植物的基因編輯研究中，在水稻中，透過CRISPR/Cas9系統對溫敏雄性不育基因TMS5進行突變,在1年內培育出11個新的轉基因無痕雄性不育品系，並且可以套用於2個水稻亞種的雜交育種，不僅加快了不育系的選育，而且也有利於雜種優勢的利用。
結論
油菜是中國主要的油料作物，也是重要的經濟作物，在油菜育種工作中，提高油菜產量一直是首要任務，而在育種工作中，開花期是一個非常重要的農藝性狀，相對於其他農藝性狀，適時開花將直接影響到油菜的成熟時期，是保證產量穩定性的前提條件，油菜的開花期主要受溫度和光周期等因素影響，相對於溫度，光周期是一個較穩定的氣候因子，不同年度的變化不大。
油菜透過響應光周期改變生育期可以達到穩產的效果，由於甘藍型油菜基因組的復雜性，圖位複制一個開花期基因受到限制，因此更多的研究是依據阿拉伯芥中的資訊，透過同源克降法對開花基因進行分析。
本研究依據阿拉伯芥中的資訊，挑選了甘藍型油菜基因BnaCO、BnaC3p7和BnaK71Z!作為靶基因，利用CRISPR技術在甘藍型油菜中進行基因定點編輯，並構建各基因每個拷貝的超表達載體轉化阿拉伯芥，初步探索甘藍型油菜中這些基因的功能，同時創造甘藍型油菜相關基因突變體材料，為更進一步的研究提供良好基礎。
