1953年，米德爾塞克斯醫院的Crosland-Taylor在Nature上發表文章，將流體力學聚焦引入了細胞檢測領域（這個原理，也稱鞘流），是流式細胞術的基礎。大約20年後，第一台商業化流式細胞儀上市。之後50年，流式細胞術被廣泛套用於基礎研究和臨床診斷。
流式細胞術的套用
一.細胞表型檢測
免疫細胞表型是流式細胞術最突出套用。
透過檢測免疫細胞群的表面或細胞內標誌物，對其進行鑒定和表征。流式細胞術能夠精確鑒定和分類免疫細胞群，例如 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、樹狀細胞、單核球、巨噬細胞、血小板和顆粒球等。
免疫細胞相關表型標誌物
T細胞標誌物
巨噬細胞標誌物
嗜中性球標誌物
成纖維細胞標誌物
DC細胞標誌物
NK細胞標誌物
髓源抑制細胞（MDSCs）標誌物
B細胞標誌物
研究人員 可以辨識和量化異質群體中的各種免疫細胞亞群。
臨床醫生 可以診斷和監測各種血液系統疾病、進行免疫免疫評估（8大類免疫細胞構成與腫瘤預後） 。
二.細胞活力檢測
流式細胞術能夠定量測量群體內和體外培養的活細胞和非活細胞。
透過使用選擇性標記活細胞或死細胞的熒光染料，流式細胞術可以提供精確可靠的活力測定，有助於確定細胞活力百分比。
1980年使用H-33342檢測死細胞和活細胞（Cytometry 1980
）
流式細胞術可以根據特定的標誌物或染料區分活細胞、雕亡細胞和壞死細胞，從而更詳細地了解細胞的健康和狀態。 透過將活力染料與細胞表面抗原、細胞內蛋白或功能測定的標記物相結合，研究人員可以在特定細胞類別或實驗條件下獲得有關細胞活力及其發生機制的全面資訊。
最常用的活性檢測染料
死細胞
：碘化丙啶（ propidium iodide，PI）和7-AAD，與DNA結合，但只能進入膜受損的細胞，使死細胞發出熒光。
雕亡細胞 ：annexin V：對磷脂酰絲胺酸具有強結合親和力的蛋白質，在細胞雕亡的早期階段暴露在質膜的外表面
annexin V+PI是常用區分雕亡細胞和壞死細胞的組合。
活細胞 ：calcein AM、CFDA（carboxyfluorescein diacetate）、FDA （fluorescein diacetate） ：進入活細胞，但只有在與細胞內酶相互作用時才會發出熒光
細胞體內增殖 ：CFSE(CFDA-SE)穿透細胞膜，在活細胞內與胞內蛋白共價結合，水解後釋放出綠色熒光。在細胞分裂增殖過程中，它的熒光強度會隨著細胞的分裂而逐級遞減，標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半，根據這一特性，它可被用於檢測細胞增殖，細胞周期的估算及細胞分裂等方面。
Front Immunol. 2013
三.細胞周期分析
從流式細胞術的早期開始，細胞周期分析就成為有價值的套用。
原理是基於熒光和核酸的量之間的關系。
常用核酸結合染料：碘化丙啶（PI），Hoechst，DAPI，7-AAD，溴化乙錠等。
流式細胞術細胞周期分可以有很多方面的套用，例如，DNA/Ki67測定可以將表型選擇與細胞周期分析相結合，用於監測p53細胞周期停滯，評估抗癌活，多藥耐藥性等。
四.離子通道測定
鈣作為關鍵的第二信使，在許多細胞訊號通路中起著至關重要的作用。它在免疫細胞活化中尤為重要，包括T細胞、B細胞和NK細胞。
T細胞鈣離子訊號（Nat Rev Immunol. 2019）
此外，鈣訊號傳導還參與肥大細胞脫顆粒、神經元興奮性、突觸傳遞和神經遞質釋放至關重要。
細胞脫顆粒的早期測量值是透過使用鈣離子載體A23187的流式細胞術確定的。
常用熒光染料：fluo-3 和indo-1。
雖然Ca2+通道測量是最常見的套用之一，但其他離子如鎂、鉀、鈉和氫也可以使用流式細胞術進行監測。
五.細胞功能檢測
最早的檢測是細胞酯酶。
使用響應氧化態變化的活性染料檢測顆粒球的氧化電位。例如，氫乙啶（hydroethidine）用於嗜中性球呼吸爆發。
二乙酸二氯熒光素（dichlorofluorescein diacetate），已被用於吞噬細胞功能研究。
效應細胞殺傷功能，是流式細胞術的另外一個重要套用。（參考文獻F., Sunga, G.M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. J. Vis. Exp. (126), e56191, doi:10.3791/56191 (2017).
細胞因子是免疫細胞功能的重要執行分子，對科學研究，免疫細胞治療，臨床診療都及其關鍵。基於流式細胞術開發的多重細胞因子檢測，已經有廣泛套用。
六.蛋白質工程
流式細胞術和分選傳統上不是蛋白質工程中最常用的技術之一。然而，近年來，在該領域的套用越來越多。
Cells 2023
流式細胞術被用於酶學蛋白質研究，包括 細胞色素P450、葡萄糖氧化酶、幾丁質酶、纖維素酶、過氧化物酶、酯酶、轉移酶、β半乳糖苷酶、硫代內酯酶等。
蛋白質工程，包括在基因水平上引入突變（隨機或特異性），以建立由數千到數百萬個單個蛋白質變體組成的文庫（如上圖），使用流式細胞術 每天能夠分析多達 10^8–10^9 個複制，並對具有所需特性的複制進行分類。
七.哺乳動物細胞和細菌細胞分選
細胞分選是流式細胞的重要套用之一，哺乳動物細胞相對成熟，不做贅述。細菌細胞方面的套用，也逐漸開始建立。
與耗時的傳統瓊脂鋪板檢測方法相比， 流式分選可以快速檢測和分選懸浮液中的單個細菌細胞。
盡管細胞分選儀具有高效能，但它們在微生物學中的套用一直受到限制。
這主要是由於微生物體積小，因此很難將它們與培養基中的細胞碎片或背景顆粒區分開來。另一個潛在的問題是，通常沒有細菌菌株特有的抗體。
限制細胞分選儀在細菌檢測和分選中的適用性的其他因素主要與分選儀硬件功能本身有關， 在流式細胞術儀器的早期，數量有限的激光器和檢測器，限制一次只能使用一種或兩種熒光染料。隨著最新儀器的發展，多激光器和檢測起的儀器被開發：包括賽默飛世爾的Bigfoot光譜細胞分選儀，BD FACSAria III分選儀，索尼MA900細胞分選儀和貝克曼庫爾特的MoFlo Astrios EQ等。
此外，部份致病性細菌，需要在BSL2以上的實驗環境下進行，現在部份流式細胞術帶有BSL 2 hood。
Cells 2023
八.液滴微流體
液滴微流體是一個相對較新的領域，專註於皮升體積中含有細胞或DNA的離散液滴的形成，操作和分析，套用於生物學、化學、材料科學和醫學。
在生物學中，液滴微流體可實作單細胞分析、生物分子的高通量篩選、細胞異質性研究和藥物發現。
流式細胞術分析是研究單細胞的強大技術，可提供有關各種參數的寶貴資訊。然而，它的測量僅限於直接連線到細胞的分子，例如表面或細胞內標記物，限制研究由細胞分泌或由DNA分子產生但不物理附的分子。 液滴微流體 提供了一種克服這一限制的新方法。將細胞或DNA封裝在單個液滴中會產生離散的區室，從而能夠分析由封裝實體釋放或產生的化合物。
DE droplet analysis via sdDE-FACs.( Lab Chip 2020)
九.下一代生物制劑
生物制藥已經占據了藥物市場的重要份額，包括治療性蛋白質（65%），疫苗（20%）等。
透過測序（NGS）進行單B細胞庫分析和複制擴增鑒定，直接從人類幸存者複制免疫球蛋白基因，分離出高親和力中和抗體，加快了單複制抗體藥物的研發， 然而，這種方法比較昂貴，且依舊需要後續的功能驗證等。
新策略可使用流式細胞術、MACS或微流體將單細胞分離與功能篩選相結合，降低開發成本並消除失敗的候選藥物，是流式細胞術新的套用開發方向。
參考資料
Crosland-Taylor, P.J. A device for counting small particles suspended in fluid through a tube. Nature 1953, 171, 37–38.
Hamori, E.; Arndt-Jovin, D.J.; Grimwade, B.G.; Jovin, T.M. Selection of viable cells with known DNA content. Cytometry 1980, 1, 132–135.
: Robinson, J.P.; Ostafe, R.; Iyengar, S.N.; Rajwa, B.; Fischer, R. Flow Cytometry: The Next Revolution. Cells 2023, 12, 1875. https://doi.org/10.3390/ cells12141875
Gennady Bocharov et al, Asymmetry of Cell Division in CFSE-Based Lymphocyte Proliferation Analysis,Front Immunol. 2013 Sep 2;4:264. doi: 10.3389/fimmu.2013.00264
Brower, K.K.; Carswell-Crumpton, C.; Klemm, S.; Cruz, B.; Kim, G.; Calhoun, S.G.K.; Nichols, L.; Fordyce, P.M. Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery. Lab Chip 2020, 20, 2062–2074.
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