编译：微科盟小黄，编辑：微科盟居居、江舜尧。
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导读
镉(Cd)污染土壤对作物生产和人类健康构成严重威胁，同时也造成土地资源的浪费。本研究在Cd污染土壤中施用两种有机肥(ZCK：低有效铁含量；Z2：高有效铁含量)进行水稻种植，并结合土壤微生物分析，探讨有机肥对水稻生长和Cd钝化的影响。结果表明， Z2可以改变微生物群落的组成、结构和多样性，增强微生物网络的复杂性和稳定性。 施用2%和5% Z2均显著提高了水稻植株的鲜重和干重，同时抑制Cd的吸收。2% Z2的Cd钝化效果最好。基因预测表明，Z2通过调节微生物产生溶解磷和钾的有机酸来促进植物生长。此外，Z2可能通过调节微生物镉的外排和吸收系统以及通过分泌胞外多糖，促进土壤Cd的吸收和固定。综上所述， Z2可以促进水稻生长，抑制水稻对镉的吸收，并通过调节土壤微生物群落来钝化土壤Cd。
图文摘要
论文ID
原名： Promotion of rice seedlings growth and enhancement of cadmium immobilization under cadmium stress with two types of organicfertilizer
译名： 镉胁迫下两种有机肥促进水稻幼苗生长并增强镉固定
期刊： Environmental Pollution
IF： 7.6
发表时间： 2024.2
通讯作者： 肖云花
通讯作者单位： 湖南农业大学生物科学技术学院
DOI号： 10.1016/j.envpol.2024.123619
实验设计
结果
1.有机肥对镉胁迫下水稻幼苗生长的促进作用
21d后水稻幼苗的生长情况如图1A-B所示，施用ZCK后水稻幼苗的各项生长指标均与CK无显著差异，但施用Z2后水稻的生长状况明显优于CK。施用2%和5%的Z2后，水稻的鲜重(0.150~0.164 g)和干重(0.021~0.026 g)显著高于ZCK(图1C~D)。在施用2%和10%的Z2后，水稻株高显著高于ZCK (p<0.05)(图1E)。不同施用处理下，水稻的根长在同一浓度下无显著差异，但随着施用浓度的增加呈负相关趋势(图1F)。
图1.水稻生长指标。A.施用不同浓度ZCK后水稻的生长情况；B.施用不同浓度Z2后水稻的生长情况；C-F分别代表水稻的鲜重、干重、株高和根长。大写字母代表不同处理之间的差异分析，小写字母代表不同浓度之间的差异分析。红线代表ZCK的回归分析，蓝线代表Z2的回归分析。
2.有机肥改变土壤理化和生化特性
种植水稻幼苗后的土壤生理生化性质如图S1所示。除TK和pH外，土壤理化性质与施肥量(0~10%范围内)呈显著正相关。此外，在2%浓度下，ZCK和Z2之间没有观察到统计学显著差异。然而，当浓度增加到5%时，Z2处理的OM含量(96.501 g/kg)显著高于ZCK处理(p<0.05)。值得注意的是，当浓度达到10%时，Z2处理的OM(160.613 g/kg)、TK(36.699 g/kg)、AN(253.078 mg/kg)和AP(48.164 mg/kg)含量显著高于ZCK处理(p<0.05)。施肥浓度对POD活性没有显著影响。然而，2%施肥浓度导致CAT和ACP活性降低。同样，5%施肥浓度导致CAT和SOD活性降低。此外，与ZCK相比，2%施肥浓度使Z2中的CAT(44.319 μmol/d/g)活性显著降低(p<0.05)，SOD(278.376 U/g)显著升高(p<0.05)。当浓度为10%时，与ZCK相比，Z2中的ACP和SOD(6021.200 nmol/d/g和297.862 U/g)表现出显著增加(p<0.05)。ZCK和Z2处理的TFe、Fe3+和Fe2+含量在各施肥浓度下均未表现出显著差异。然而，与CK相比，ZCK和Z2的施用显著增加了Fe3+含量。此外，在10%浓度下，Z2处理的Fe2+含量(0.74 g/kg)显著高于CK(0.47 g/kg)(p<0.05)。
3.有机肥抑制水稻幼苗对镉的吸收
水稻中总Cd含量随施肥量的增加而显著降低(p<0.05)(图S2A)。ZCK和Z2在三种浓度下均能降低水稻地上部分的Cd积累(图S2B)。与ZCK相比，Z2在2%浓度下显著降低水稻地下部分Cd富集，而在5%和10%浓度下无显著差异(图S2C)。不同施肥浓度和处理之间TF无显著差异，但Z2的TF随着施肥浓度的增加呈下降趋势。
施肥21 d后，土壤中Cd各形态所占比例发生变化。施肥量的增加导致残渣态Cd含量减少，可还原态Cd含量增加。然而，在2%浓度下，与CK相比，ZCK和Z2中弱酸提取态和可还原态Cd的比例均有所下降。相反，在相同条件下，可氧化态和残渣态Cd所占比例有所增加。值得注意的是，在所有处理中，施用2% Z2处理下弱酸提取态比例最低(4.18%)，残渣态比例最高(85.75%)，表明其对Cd的钝化效果最好。
4.有机肥改变土壤微生物群落的多样性、结构和组成
Shannon指数用于评估微生物群落的多样性。在细菌多样性方面(图2A)，相同施肥量下，Z2与ZCK之间无显著差异。但随着施肥量的增加，细菌多样性降低。值得注意的是，与CK相比，施用2% Z2导致细菌多样性显著增加。在真菌多样性方面(图2E)，随着施肥量的增加，ZCK处理的的多样性呈下降趋势。另一方面，不同施肥量下Z2的多样性无显著差异。值得注意的是，在2%浓度下，ZCK的多样性显著高于Z2。此外，与CK相比，所有浓度下Z2处理的多样性都有所下降，而ZCK的多样性仅在10%施肥量下降低。NMDS用于可视化微生物群落组成的差异(图2B和F)。不同处理之间的微生物结构存在显著差异(p=0.001)。同时，随着施肥浓度的增加，细菌结构呈现出一定的变化规律。
弦图显示了属水平上的微生物群落组成。其中，铁还原细菌 Anaeromyxobacter 和铁氧化细菌 Massilia 作为优势属，参与了土壤中铁离子的还原和氧化。此外，CK中前3个细菌是 Sphingomonas 、 un classified_Oxalobacteraceae 和 Gemmatimonas 。AZCK中前3个细菌是 Flavisolibacter 、 un classified_Comamonadaceae 和 Gemmatimonas 。BZCK中前3个细菌是 Flavisolibacter 、 un classified_Longimicrobiaceae 和 Lysobacter 。CZCK中前3个细菌是 Longimicrobiaceae 、 Lysobacter 和 Flavisolibacter 。AZ2中前3个细菌是 Flavisolibacter 、 Gemmatimonas 和 Sphingomonas 。BZ2中组成前3个细菌是 un classified_Longimicrobiaceae 、 Lysobacter 和 Gemmatimonas 。CZ2中前3个细菌是 un classified_Longimicrobiaceae 、 Lysobacter 和 un classified_Rhizobiaceae (图2C)。CK和AZ2中前3个真菌是 Fusicolla 、 un classified_Fungi 和 Exophiala 。AZCK、BZCK和CZCK中前3个真菌是 Fusicolla 、 un classified_Fungi 和 un classified_Ascomycota 。BZ2中是 Fusicolla 、 Mycothermus 和 un classified_Fungi 。CZ2中是 Fusicolla 、 Mycothermus 和 un classified_Sordariomycetes (图2G)。种水平的花瓣图显示了共有和特有的微生物种类。施肥后，与空白相比，细菌的特有物种数量普遍减少(图2D)。相反，除AZCK和CZ2处理外，真菌的特有物种普遍增加(图2H)。此外，在细菌物种中共鉴定出220个共有物种，而在真菌物种中观察到106个共有物种。
图2.微生物群落分析。A-D分别表示细菌Shannon指数、非度量多维标度分析(NMDS)、组成弦图和OTU花瓣图；E-H分别代表真菌Shannon指数、NMDS、组成弦图和物种水平的花瓣图。
5.通过LEfse分析鉴定差异基因
LEfse分析揭示了组间丰度存在显著差异的微生物(图3)。在细菌中，CK的主要差异菌属是 Desulfosporosinus 、 Ellin6067 和 AlphaIcluster 。AZCK和BZCK的主要差异菌属是固氮细菌，如 Azohydromonas 、 Microvirga 和 Anaeromyxobate 。 Bacillus 是CZCK的主要差异属，能够促进植物生长并减少Cd积累。AZ2的主要差异菌属是 Arenimonas 、 Turiciactor 和 JGI_0001001_H03 。BZ2和CZ2的主要差异菌属是Cd修复菌，如 Steroidoactor 、 Gemmatimonas 、 Pseudomonas 和 Lysobacter 。在真菌中，CK的主要差异菌属是 Fusarium 、 Galactinomyces 和 Coniochaeta 。AZCK的主要差异菌属是 Pseudoeurotium 、 Aspergillus 和 Condenascus 。BZCK的主要差异菌属是 Talaromyces 、 Rhodotorula 和 Capronia 。CZCK的主要差异菌属是 Coprinopsis 、 Kernia 和 Neodidymelliopsis 。AZ2主要的特异菌属是 Myxosephala 、 Cercospora 和 Rhizoctonia 。BZ2的主要差异菌属是 Clariredia 、 Kuraishia 和 Leohumicola 。CZ2的主要差异菌属是 Arcopilus 、 Feromyces 和 Melanocarpus 。
图3. LEfse差异分析。分析选择了每种处理的前5个属(LDA值，不包括未分类和未鉴定的属)。A表示细菌，B表示真菌。
6.有机肥增加了微生物共现网络的复杂性
微生物共现网络如图4所示，其具体参数见表1。与CK相比，施肥后土壤微生物网络的复杂性增加。同时，网络中细菌的比例增加，正相关和负相关趋于平衡，使网络更加稳定。在ZCK样本中，BZCK表现出最高的节点数(108)和边数(1821)，形成了最复杂的网络结构。同样，在Z2样本中，AZ2表现出最高的节点数(107)和边数(1779)，显示出最复杂的网络配置。此外，施肥促进了模块化水平的提高，进一步增强了网络的稳定性。图4I所示的鲁棒性分析证实，施肥网络比CK具有更好的抗干扰能力。在相同的施肥浓度下，Z2在2%浓度下表现得更复杂，而ZCK在5%和10%浓度下表现出更大的复杂性。
图4.物种水平的共现网络分析。基于物种丰度组成相关分析的Spearman相关计算方法构建的微生物网络。参数为p值0.05，丰度阈值0.001，相关系数0.6。A-G表示不同处理的微生物网络，H表示鲁棒性分析。
表1.微生物共现网络的拓扑参数。(原文表2)
7.微生物与土壤理化生化性质的相关性分析
相关性分析(图5)表明，细菌多样性与土壤全铁(TFe)、有机质(OM)、全氮(TN)、全磷(TP)、碱解氮(AN)、速效磷(AP)和速效钾(AK)显著相关。然而，细菌结构与土壤生理生化特性之间没有显著相关性。进一步分析镉相关细菌和土壤生理生化特性发现， Desulfosporosinus 和 Sphingomonas 与土壤理化性质(除pH外)呈显著负相关，而 Steroidobacter 、 Pseudomonas 和 Lysobacter 与土壤理化性质(除TFe和pH外)呈正相关。此外， Bacillus 与土壤理化性质(除TFe、pH和TK外)呈显著正相关。关于细菌与土壤生化特性的相关性，发现所有这些细菌都与过氧化氢酶(CAT)有关，其中 Desulfosporosinus 和 Sphingomonas 与CAT呈负相关，而 Steroidobacter 、 Pseudomonas 、 Lysobacte r和 Bacillus 与CAT呈正相关。
真菌多样性与土壤Fe²⁺、有机质(OM)、全氮(TN)、全磷(TP)、全钾(TK)、碱解氮(AN)、速效磷(AP)、速效钾(AK)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)显著相关。真菌结构与TN、TP、AP、AK和超氧化物歧化酶(SOD)显著相关。进一步分析镉相关真菌与土壤生理生化特性，发现 Exophiala 和 Rhodotorula 与土壤生理生化特性有很强的相关性。其中， Exophiala 与土壤酸性磷酸酶(ACP)、POD和SOD呈显著正相关，与土壤TN、TP、AN、AP、AK和OM呈显著负相关。 Rhodotorula 与土壤理化性质(除TFe和pH外)呈显著正相关，与土壤ACP显著负相关。
图5.相关性分析。A.细菌多样性和结构与土壤生理生化特性的相关性。*表示存在显著差异(p＜0.05)；B.真菌多样性和结构与土壤生理生化特性的相关性，*表示存在显著差异(p＜0.05)；C.镉相关细菌与土壤生理生化特性的相关性；D.镉相关真菌与土壤生理生化特性的相关性。
8.探索促进植物生长或镉钝化相关基因
本研究基于PICRUSt2预测微生物功能基因，并鉴定了一些与促进植物生长和镉钝化相关的关键基因/酶/蛋白。
在不同处理和施肥浓度下，细菌中这些基因/酶/蛋白的相对丰度如图S3所示。施肥后，与CK相比，ZCK和Z2都显示出固氮酶显著减少，并且随着施肥浓度的增加而呈显著下降趋势(p<0.05)。在2%浓度下，ZCK的色氨酸2-单加氧酶显著高于Z2和CK(p<0.05)。在5%和10%浓度下，Z2的醛脱氢酶(NAD(+))显著高于ZCK和CK(p<0.05)。ZCK的异柠檬酸脱氢酶(NADP(+))在2%和10%浓度下显著高于Z2，Z2显示出随施肥浓度增加而显著下降的趋势(p<0.05)。在2%浓度下，Z2的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP)显著高于ZCK和CK(p<0.05)。酸性磷酸酶随着施肥浓度的增加呈显著上升趋势(p<0.05)，并且在5%和10%浓度下，Z2显著高于ZCK和ZC(p<0.05)。碳酸脱水酶和D-半胱氨酸脱巯基酶显示出随施肥浓度增加而显著下降的趋势(p<0.05)，在5%浓度下ZCK的碳酸脱水酶显著低于Z2，但在10%浓度下显著高于Z2(p<0.05)。CzcABC调控基因编码跨膜和细胞膜外排蛋白。CzcABC调控基因随着施肥浓度的增加呈显著下降趋势(p<0.05)，在2%和5%浓度下，Z2显著低于ZCK和CK(p<0.05)。Cad操纵子(CadC)的转录激活因子是一种属于ArsR家族的负调控转录因子，通过与Cd和其他金属离子结合来感知环境中的金属浓度。在2%浓度下，Z2的CadC显著高于ZCK。Z2的锌转运蛋白在2%和5%浓度下显著低于ZCK和CK。胞外多糖(EPS)生产蛋白随着施肥浓度的增加呈显著上升趋势(p<0.05)，并且在2%、5%和10%浓度下，Z2显著高于ZCK和CK(p<0.05)。
不同处理和施肥浓度下真菌中这些酶的相对丰度如图S4所示。不同施肥处理之间的差异主要在2%浓度时观察到。在该浓度下，ZCK的异柠檬酸脱氢酶(NADP(+))和PEP羧激酶显著高于Z2，而Z2的醛脱氢酶、酸性磷酸酶和碳酸脱水酶显著高于ZCK。
讨论
1.两种有机肥对土壤镉钝化的影响
镉是一种重要的环境污染物，严重影响作物的生长和发育。本研究探讨了施用不同浓度的两种有机肥对土壤Cd钝化的影响。结果显示，与CK相比，添加ZCK并未显著改善镉的固定。然而，对照组(CK)和ZCK相比，施用2% Z2减少了土壤中弱酸提取态Cd的含量，并增加了残渣态Cd的比例。这可能是因为Z2能够增加土壤中有效铁的含量，而铁(羟基)氧化物可以通过吸附和同构取代来螯合Cd。LEfse分析显示，添加Z2后， Steroidobacter 、 Lysobacter 、 Kuraishia 等微生物成为主要属。这些微生物表现出对镉胁迫的抗性，可能通过产生胞外酶或多糖减轻镉毒性，使镉沉淀或被吸附。细菌中的基因预测表明，Z2显著增加了胞外多糖(EPS)产生蛋白的相对丰度，这种蛋白可以生成能够吸附和固定Cd(II)离子的胞外多糖。同时，czcABC调控基因的相对丰度降低减少了细菌体内Cd离子的外排。此外，酸性磷酸酶水解有机磷酸酯并释放无机磷酸盐，碳酸脱水酶催化二氧化碳和水生成碳酸，D-半胱氨酸脱巯基酶参与半胱氨酸生成硫化物的代谢途径。生成的磷酸根离子、碳酸根离子和硫离子可以进一步与Cd离子反应生成难溶性沉淀。相比于ZCK，施用5% Z2显著增加了酸性磷酸酶和碳酸脱水酶的相对丰度，而D-半胱氨酸脱巯基酶则显著减少。这表明在该浓度下，D-半胱氨酸脱硫酶不再是参与镉钝化的主要酶。此外，在真菌的基因预测中，与ZCK相比，施用2% Z2显著增加了酸性磷酸酶和碳酸脱水酶的相对丰度，而其他浓度并未表现出显著变化。这可能归因于它们在土壤环境中的不同生态作用，导致它们对不同浓度的Z2有不同的响应。
综上所述，施用Z2后，水稻土中的微生物群落发生了变化。抗镉微生物的新优势可能主要通过分泌磷酸盐、生成胞外多糖和调控镉转运相关基因来吸附和沉淀土壤中的有效镉。同时，施用Z2形成的氧化铁也可以吸附部分有效镉。
2.两种有机肥对镉胁迫下水稻生长的影响
在镉胁迫下，水稻容易产生大量活性氧(ROS)，导致氧化损伤。铁是植物生长和发育的必需元素，以铁肥的形式施用可以调节水稻的生理和代谢过程，从而增强其抗氧化能力。本研究发现，施用两种有机肥可以促进水稻生长并抑制镉的吸收，其中Z2的效果明显优于ZCK(见图1和图S2)。Z2中的主要差异属，如 Mycobacterium 和假单胞菌属( Pseudomonas )，具有分泌大量生长调节因子的能力，有助于促进水稻生长。同时，施用Z2增加了土壤微生物网络的稳定性和复杂性，有助于水稻幼苗抵抗逆境。相关性分析进一步显示，假单胞菌属与土壤理化性质呈正相关。有趣的是，细菌基因预测显示，与CK相比，施肥后固氮酶的相对丰度显著降低。这一现象可能归因于在养分丰富的土壤中，植物已能够自行吸收足够的养分。因此，这也可能是由于细菌产生的吲哚乙酸减少。醛脱氢酶(NAD+))和酸性磷酸酶相对丰度的增加可能是促进植物生长的主要原因。醛脱氢酶(NAD+))在水稻根部起到解毒作用，并能提供有机酸来促进植物生长。酸性磷酸酶可以生成更多无机磷源，这也可能是土壤有效磷含量增加的主要原因。此外，铁的有效性提高可促进土壤中游离镉的沉淀，从而减少水稻幼苗对镉的吸收。
需要注意的是，Z2的施用量需要根据实际土壤条件和Cd污染水平进行合理调整，以达到最佳效果。本研究发现，施用2% Z2对水稻生长最有利，而施用10% Z2则最有效地抑制了水稻幼苗对镉的吸收。观察到不同浓度的Z2对水稻幼苗镉吸收的影响可能归因于铁的螯合特性。高浓度的铁可以与镉离子形成强络合物，降低其对植物吸收的生物利用度，但过量的铁摄取也可能导致对植物组织的毒性和损伤，特别是在负责养分和水分运输的皮层区域，这可能阻碍植物内部铁的运输，从而导致生长和发育缺陷。
结论
在镉污染土壤中施用有机肥可以改变水稻种植中微生物群落的组成、多样性和结构，从而增强微生物网络的复杂性和稳定性。与CK和ZCK相比，在镉污染土壤中施用2%和5% Z2显著提高了水稻幼苗的鲜重和干重。施用2% Z2可以提高残渣态Cd的比例，有效减轻土壤中镉的毒性。因此，Z2可能成为农业轻度镉污染土壤修复和生产的强有力材料。
