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导读
干旱胁迫严重制约辣椒( Capsicum spp.)的生长、产量和品质。独脚金内酯（SL）是一种相对较新的植物激素，有望缓解辣椒植株的干旱相关症状。然而， 关于叶面施用SL后暴露于干旱胁迫（DS）时如何影响辣椒的基因表达的知识有限。为了探索这一点，本研究进行了生理学和转录组分析，以揭示SL减轻DS对辣椒幼苗影响的机制。结果发现，DS抑制辣椒幼苗生长，改变抗氧化酶活性，降低相对含水量（RWC），并引起氧化损伤 。相反， SL的施用显著提高了RWC，促进了根系形态，增加了叶片色素含量。SL还通过降低MDA和pO2水平以及维持POD、CAT和SOD活性来保护辣椒幼苗免受干旱诱导的氧化损伤 。此外， 转录组学分析显示，在DS和DS+SL处理中，差异表达基因在核糖体、ABC转运蛋白、苯丙烷生物合成和生长素/MAPK信号通路中富集 。此外，qRT-PCR结果显示，与仅干旱处理相比，SL处理中 AGR7 、 ABI5 、 BRI1 和 PDR4 上调， SAPK6 、 NTF4 、 PYL6 和 GPX4 下调。特别是SL信号转导的关键基因 SMXL6 在干旱条件下被下调。这些结果阐明了SL介导的植物DS耐受性的分子方面，并为有效实现辣椒抗旱性提供了关键策略。
论文ID
原名： Physiological and Transcriptome Analysis of the Effects of Exogenous Strigolactones on Drought Responses of Pepper Seedlings
译名： 外源独脚金内酯对辣椒幼苗响应干旱胁迫的生理和转录组分析
期刊： Antioxidants
IF： 7
发表时间： 2023年11月
通讯作者： 汪志伟
通讯作者单位： 海南大学
DOI号 ： 10.3390/antiox12122019
实验设计
结果
1 SL缓解了干旱胁迫对辣椒形态的负面影响
为了证实SL在DS环境中对辣椒生长的可能影响，研究人员检测了对照组、DS组和DS+SL组的辣椒形态。 DS对辣椒幼苗根系生长有明显的抑制作用。 SL预处理能有效缓解DS的抑制作用，在DS条件下，植株的根长、表面积、体积、根尖、根交叉和根分叉分别比对照处理减少49.56%、59.45%、65.27%、32.31%、55.7%和56.62%。 此外，SL预处理后，与对照组相比，减少率分别仅为20.13%、35.48%、35.71%、15.4%、29.11%和22.63%。重要的是， SL的叶面施用显著促进了DS环境中辣椒幼苗的根系结构系统 （图1）。 这些结果表明SL可以维持根系的正常生长和平衡吸水。
图1. 辣椒幼苗的表型变化。 （A）辣椒植株和根系在不同处理下的表型。（B）根的总长度、（C）根表面积、（D）根体积、（E）根尖、（F）根交叉和（G）根分叉。对照：在正常对照条件下，DS：干旱条件，DS+SL：施用SL的干旱条件。数据是平均值和标准误差；黑点表示三个生物复制品。不同的字母表示不同处理之间的显著差异（ p ＜0.05）。
2 叶片组织的显微结构
研究人员评估了不同处理的植物的气孔特性，以检测SL对其在DS下气孔打开和关闭能力的影响 （图2）。SEM显示，与对照组相比，在仅干旱处理中，植物气孔完全闭合（图2B）。在SL和DS条件下施用时，气孔关闭减轻，表明外源SL可以改变DS引起的气孔开放（图2C）。此外，与对照组相比，气孔面积减少了98%；然而，在干旱胁迫下，SL叶面施用使气孔面积增加了57.45%（图2D）。 SL叶面施用可以通过调节细胞通透性来维持叶片中的水分水平，从而促进气孔的打开 。
图2. 在对照条件、DS（干旱条件）和DS+SL（干旱条件下施用SL）下，辣椒植株气孔开度性能和生理分析的综合效应。 （A-C）气孔孔径性能；（D）不同处理组气孔面积的分析；（E）测定的相对含水量；（F）叶片的总叶绿素；（G）叶片叶绿素a；和（H）叶片的叶绿素b。数据是平均值和标准误差；黑点表示三个生物复制品。不同的字母表示不同处理之间的显著差异（ p ＜0.05）。
3 叶片的相对含水量和叶绿素含量
干旱严重影响了辣椒幼苗的RWC和叶绿素含量。 只有DS处理的RWC（76.57%）低于对照组（90.61%）。值得注意的是，用DS+SL处理的辣椒的叶片RWC（86.35%）显著高于仅在干旱条件下生长的辣椒（图2E）。干旱处理显著降低了辣椒幼苗叶片中的叶绿素含量。与对照相比，辣椒幼苗中总叶绿素、叶绿素 a 和叶绿素 b 的浓度分别下降了28.8%、26.82%和21.91%。然而，与DS处理植物相比，DS+SL植物表现出相当高的叶绿素含量，分别增加了23.69%、22.33%和12.78%（图2F-H）。
4 抗氧化酶活性和相关代谢产物的测量
DS +SL处理显著影响辣椒幼苗抗氧化酶（POD、CAT和SOD）活性 。与对照组相比，DS显著提高了POD、CAT和SOD活性。然而，预处理SL抑制了辣椒幼苗叶片中的酶活性。例如，DS的POD、CAT和SOD活性仅比对照组高180.86%、93.59%和107.02%。相反，DS+SL组的酶活性低于仅DS组（图3A-C）。与对照组相比，仅DS组的脯氨酸、MDA和pO2显著增加。相反，与DS组相比，DS+SL植物的脯氨酸、MDA和pO2含量显著降低，分别为88.39%、57.89%和61.83%（图3D-F）。在DS条件下，可溶性糖含量增加。此外，DS和DS+SL处理没有显著差异（图3G）。
图3. 对照、DS和DS+SL辣椒植株叶片中酶活性和非酶抗氧化剂含量的影响。 （A）POD、（B）CAT和（C）SOD的抗氧化酶活性；（D） 脯氨酸含量、（E）MDA含量、（F）pO2含量和（G）可溶性糖含量。数据是平均值和标准误差；黑点表示3个生物重复。不同的字母表示不同处理之间的显著差异（ p ＜0.05）。
5 RNA-seq数据评估和差异表达基因分析
本研究的三组转录组测序共产生40320 kb原始数据，研究者对其进行低质量reads过滤，得到3869万个clean reads。研究发现，88.58-93.36%的reads可以成功比对到辣椒（ C.chinense ）参考基因组，唯一比对率在85.35-89.02%之间（表S2）。层次聚类分析显示，同一处理的不同样本聚集在一起，DS+SL组表现出最显著的差异（图4A）。 转录组被分为四个DEG簇，每个簇中的基因具有相似的表达模式，分别包括95、1481、159和25个DEG （图4B）。 在DS vs 对照组、DS+SL vs 对照组和DS vs DS+SL组中共鉴定出2097个DEG 。韦恩图显示，只有2个基因在所有组别中都有表达，而且在所有三个组别中，特异性DEGs都高于共享DEGs（图4C）。此外，与对照组相比，DS组和DS+SL组分别有410个和849个DEG。此外，DS组和DS+SL组之间存在838个DEG（图4D）。
图4. 三组在不同处理下的DEGs。 （A）DEG的热图和聚类分析表达，（B）RNA-seq数据的4个子聚类的放大区域。灰色线表示基因的相对校正基因表达水平，蓝色线表示所有基因的相对纠正基因表达水平、（C）三组DEG的韦恩图和（D）DEG的数量的一致性。
6 DEGs的富集分析
研究者比较对照组和DS组的DEG，发现后者富集在半乳糖代谢、植物激素信号转导、光合作用和光合作用天线蛋白。当比较对照和DS+SL时，发现后者富集在氨基酸生物合成、油菜素甾体生物合成、类胡萝卜素生物合成和MAPK信号传导。 有趣的是，与对照组相比，DS和DS+SL组在核糖体途径中表现出显著富集。 DS和DS+SL处理之间鉴定的DEG富集在苯丙烷生物合成、萜类骨架生物合成、类黄酮生物合成、类胡萝卜素生物合成和MAPK信号通路 （图5、图S1和表S3）。此外，如GO的分子和生物功能所描述的，感兴趣的基因被分类为分子功能（MF）、细胞成分（CC）和生物过程（BP）。 研究者进行GO功能注释，以充分了解DEG在对照组、DS组和DS+SL组中的作用 （图S2）。
图5. 与干旱和SL处理相关的富集途径。 （A） 植物激素转导，（B）MAPK信号，和（C）苯丙烷生物合成途径。热图颜色从左到右显示控制、DS和DS+SL的FPKM的log2值。
7 参与干旱和SL处理的候选基因
基于富集分析，研究人员鉴定了71个基因，其表达在对照组、DS组和DS+SL组之间显示出显著差异，这表明它们可能对DS有反应或参与SL诱导的DS缓解。与苯丙类化合物生物合成途径相关的基因在单独的DS组和DS+SL组之间大量富集，并确定了18个差异表达基因。 有趣的是，与苯丙烷生物合成相关的基因 BC332_05436 （ cytochrome 84A1 ）和 BC332_01431 （ peroxidase 15 ）在DS+SL组中的表达显著高于DS组植物。相反， BC332_25211 （ 4-coumarate -- CoA ligase 2 ）、 BC332_33581 （ caffeoyl-CoA O-methyltransferase ）和 BC332_34596 （ caffeoyl-CoA O-methyltransferase ）在DS+SL中的表达显著低于单独的DS组。此外， 与对照组相比，在单独DS和DS+SL处理的植物中，与植物激素信号转导和MAPK途径相关的基因显著富集。 BC332_22503 （ indole-3-acetic acid-induced protein ARG7 ）和 BC332_09592 （ BRI1 kinase inhibitor 1 ）在DS+SL组中表达明显，在DS组中表达较低。此外， 研究人员从DEG中鉴定了15个SL生物合成相关基因。参与SL生物合成的基因的表达谱在对照组、DS组和DS+SL组之间显示出显著差异。 与DS组相比， BC332_23620 （ SMAX1-LIKE 6 ）、 BC332_15224 （ SMAX1_LIKE 7 ）和 BC332_18735 （ SMAX1/LIKE 4 ）在DS+SL中的表达更高。此外， 研究者在ABC转运蛋白途径中鉴定了23个基因 。与对照处理相比，基因 BC332_30010 、 BC332_33666 和 BC332_16040 在DS+SL处理中上调，但在DS处理的植物中下调（图6）。此外，研究人员获得了脯氨酸和抗氧化酶生物合成基因的mRNA水平，这在分子水平上进一步阐明了候选基因（图S3）。
图6. 与干旱和SL处理相关的DEG分别在对照、DS和DS+SL中的表达。 热图颜色显示FPKM的log2值。
8 基因表达的qRT-PCR验证
研究者选择15个与DS密切相关的候选基因用于通过RNA-Seq分析表达（表S4）。研究使用对照组作为对照，同时对DS组和DS+SL组进行研究，以验证本研究中获得的RNA-seq数据的可靠性（图7）。
图7. DEGs相对表达水平的qRT-PCR验证。 数据是平均值和标准误差；黑点表示3个生物重复。
讨论
干旱被公认为阻碍植物生长和发育的主要非生物胁迫因素。几种植物激素在调节植物应激反应中的关键作用已得到广泛认可。SL在调节植物发育和减轻环境压力方面具有至关重要的作用。此外，SL的叶面施用通过改善光合特性和抗氧化酶活性来增强DS条件下的植物生长。然而，关于其对辣椒非生物胁迫反应的影响的信息很少。
DS显著抑制植物生长。 在本研究中，在DS条件下，辣椒幼苗的根和叶受到不利影响。SL预处理可以缓解辣椒的干旱症状。在干旱胁迫处理中，枯萎的幼叶表现出下垂和收缩的迹象，大多数成熟的叶片已开始卷曲，而DS+SL处理的叶片仅表现出轻微症状（图1和图2E）。 因此， 研究结果表明，SL的施用减少了DS条件下辣椒幼苗的明显干旱损伤。 植物中的叶绿素含量是光合活性的关键指标，但在胁迫条件下，这一特性会受到不利影响。DS显著降低了叶绿素含量。此外，SL在调节植物光合效率方面发挥着至关重要的作用。 本研究结果表明，外源施用SL显著缓解了DS条件下叶绿素含量的下降 （图2F-H） 。因此，这表明SL是辣椒对抗DS的有效物质 ；在葡萄中也报道了类似的结果。 因此，施用SL很可能是一种可以用来减轻DS对辣椒幼苗不利影响的方法。
脯氨酸被认为是环境胁迫条件下植物细胞内合成的一种重要代谢产物。它被认为对在胁迫下生长的植物的保护功能有重大影响，这归因于它作为渗透保护剂、膜稳定剂和ROS清除剂的能力。先前的文献表明，脯氨酸积累可能有助于改善水分状况，减少非生物胁迫引起的氧化损伤。同样， 研究人员观察到DS显著增加了辣椒植株中脯氨酸的积累。相反，SL的施用显著降低了DS条件下辣椒幼苗中的脯氨酸浓度 （图3D）， 这表明SL在DS期间对渗透调节具有潜在的效率效应，这可能有助于植物维持生长和功能 。脯氨酸生物合成基因（ AtP5CS1 ）在非生物胁迫条件下增加脯氨酸生物合成中起关键作用。研究人员发现，在有或没有SL的干旱条件下， P5CS （ BC332_15138 ）的mRNA水平在辣椒中增加（图S3）。 SL的应用导致脯氨酸含量显著降低，这表明P5CS转录水平的上调可能有助于脯氨酸浓度的增加。 然而，SL影响脯氨酸的机制尚不清楚，需要进一步探索。
在受到环境胁迫的植物中，维持氧化还原稳态对于减轻ROS的过度产生和最大限度地减少细胞膜损伤至关重要。 在本研究中，DS下pO2和MDA含量显著增加，而SL通过抑制pO2和丙二醛含量的积累来逆转DS诱导的辣椒幼苗的氧化损伤 （图3E，F）。SL介导的干旱反应可能涉及pO2含量和气孔关闭的复杂相互作用。植物可能有必要维持某些基因的表达，以将气孔开放度维持在特定水平，从而在缺水条件下平衡CO2流入和水分损失。研究人员认为，在DS过程中，气孔被牢牢关闭。然而，SL的应用在缓解气孔关闭方面有显著效果（图2C），表明SL在调节植物的水分平衡方面发挥着至关重要的作用，导致气孔在DS下重新开放。这是一个复杂的分子机制，仍需进一步研究。为了应对氧化损伤，植物已经开发出一种成熟的抗氧化防御机制。研究表明， SL可以增强抗氧化酶对ROS解毒的活性，从而赋予作物耐受性。与DS组相比，在DS+SL组中检测到较低水平的POD、CAT和SOD活性，这表明SL可以提高ROS清除效率，并可能保护植物免受DS的不利影响，从而减轻DS引起的氧化应激（图3A-C）。 此外， 研究人员评估了过氧化物酶4（ POD4 ）和过氧化物酶（ POD15 ）的表达水平，它们是参与苯基丙烷生物合成途径的基因。 在干旱暴露的幼苗中， POD15 的表达降低，而SL的施用显著增加了这些基因的表达水平，这与转录组学结果一致。相反，SL处理后， POD4 几乎没有表达（图7）。 POD 基因的转录水平是否有助于提高抗旱性或阻碍抗旱性值得进一步研究。
SL有效调节植物生长，以应对各种环境条件。拟南芥的生理和分子分析表明，植物激素信号通路对调节干旱或缺水反应至关重要。 OSRK1 （ SAPK6 ）是水稻根系胁迫信号传导的上游调控因子，在ABA和高渗胁迫信号传导中发挥重要作用。 本研究发现，用SL预处理的植物在DS过程中表现出与植物激素信号转导和MAPK信号转导途径相关的显著基因变化 （图5和图6）。具体而言，研究人员观察到Aux/IAA家族生长素反应蛋白的表达变化，这些蛋白在植物胁迫反应中起着关键作用。ROS浓度的增加对IAA turnover周转产生负调控影响。有趣的是， 在本研究中，研究者发现DS组 ARG7 （ BC332_22503 ）的表达水平降低了97.9%，而DS+SL组则显著升高 。此外，发现 BC332_20130 （ SAPK6 ）编码激酶在没有SL处理的DS反应中上调，但在SL预处理的组中显著下调。研究人员假设这些基因可能通过SL的作用来减轻DS。
ABC转运蛋白现在被认为参与了许多生理过程，使植物能够适应环境变化。多能耐药（PDR）亚家族ABC蛋白存在于许多植物中，可应对生物和非生物胁迫。先前的一项研究表明，ABC转运蛋白 AtABCG36/AtPDR8 的过表达使植物比野生型植物更能抵抗干旱和盐胁迫。相反，敲除系比野生型植物对DS更敏感。 研究人员发现，在DS条件下SL预处理后， BC332_16040 （ PDR4 ）显著上调，这意味着 PDR4 可能在对DS和SL的反应中发挥关键作用。 先前的研究表明， MAX2 和 DWARF14 之间的相互作用触发SL的信号转导，而 SMXL6 （ SUPPRESSOR OF MAX1-Like 6 ）起到SL信号转导抑制剂的作用。 MAX2 突变体对DS表现出高度敏感性。最近的一项研究发现，拟南芥中 SsMAX2 的过表达显著增强了对干旱、渗透和盐胁迫的抵抗力。此外， SMXL6 、 SMXL7 和 SMXL8 在拟南芥DS过程中发挥负调控作用。 研究人员发现 BC332_17885 （ CcsMX1 ）的表达水平在DS下上调，但在SL处理下下调（图7），表明其在DS反应中的负调控作用 。相反， CcsMX26 的表达呈现相反的趋势。对行动机制的调查是难以捉摸的，需要进一步调查。
图8. SL诱导辣椒幼苗耐受干旱胁迫的机制综述。
总之， 本研究的综合研究，包括表型观察、生理测量和基因表达分析，证明了SL对DS环境中辣椒植物的多方面积极影响。SL有效地减轻了DS的不利影响，并在这种具有挑战性的条件下促进了辣椒幼苗的生长 。 SL的应用是对抗干旱诱导的氧化损伤和增强对DS耐受性的有力工具 ，最终促进辣椒植物的整体健康发育。此外， 本研究结果强调，对DS反应至关重要的DEG主要与MAPK和植物激素信号转导途径有关 。这些见解有助于更深入地理解辣椒抵抗DS能力的分子和生理机制，并为阐明SL如何在辣椒对干旱胁迫的适应性反应中与不同的信号通路复杂相互作用提供了一个有价值的概念框架（图8） 。这项研究为未来研究在面对环境挑战时提高作物的复原力和可持续性奠定了坚实的基础。
