文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
西瓜甘甜多汁，清爽解渴，维生素C等物质含量丰富，营养价值高，具有重要的经济价值，广受大家喜爱。
西瓜是我国乃至全世界最重要的园艺作物之一 ，在世界范围内广泛种植，据估计全球西瓜的产量大约为8亿吨/年，我国是世界上最大的西瓜产地与消费国，西瓜的播种面积超过3000万亩，研究表明，食用适量的西瓜能减少慢性病的发生。
西瓜枯萎病
在我国西瓜产业蓬勃发展，产量剧增，长期连续单作使西瓜产生连作障碍，其表现方式之一就是西瓜枯萎病的大面积发生。
西瓜枯萎病通常会使西瓜减产15%～30%， 严重时可使西瓜减产50%～85% ，甚至绝收，尖孢镰刀菌属半知菌类、从梗孢目、瘤座孢科、镰刀菌属，是一种最重要的土传病原菌，被评为世界第五大病原真菌。
尖孢镰刀菌的分生孢子和菌丝体通常以腐生的方式存在于植物残体中，厚垣孢子和菌丝可在土壤中存活5～6年。
病原菌潜伏在土壤中越冬或越夏， 通过带病种子、田间昆虫的移动、灌溉和堆肥传播，尖孢镰刀菌FON 一般通过西瓜植株的伤口、裂口或者根尖侵入，侵入后一般在根皮层细胞间繁殖，随后侵入木质部，不断向上侵染。
FON可分泌毒素，干扰西瓜植株的正常代谢 ，分泌果胶酶和纤维素酶，降解植物细胞壁，导致植株枯萎死亡。
病原物鉴定最经典的方法就是通过病害症状识别、症状鉴定和生物学特性分析等方法进行判断，该鉴定方法不仅鉴定周期长。
同时需要相关操作人员具有丰富的专业知识 ，难以满足病害防控需求，并且在病原真菌的检测鉴定中，许多真菌病原体会产生相似的症状，难以区分不同的物种。
随着分子生物学的蓬勃发展，基于分子检测手段对病原物进行鉴定的方法越来越普遍，该方法可缩短鉴定周期，提高鉴定的准确性。
在之前，有研究人员利用参与细胞DNA合成、重组和修复的蛋白开发了重组酶聚合酶扩增技术，该技术主要依赖三种在37～42℃具备活性的重组酶、聚合酶和单链结合蛋白，目前该技术已由TwistDx商业化。
RPA的扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳进行检测， 可与探针结合进行实时定量检测 ，也可与侧流层析试纸条结合进行结果的即时检测和观察。
RPA检测技术具有操作简单、特异性强、灵敏度高等优点，检测下限可达fg级别且反应只需要1对引物，在恒温37～42℃即可产生爆发式扩增，所需温度低；10～15min即可完成检测，反应所需时间短。
有研究表明在缺少相关试验设备的情况下利用人体体温也可以进行RPA扩增反应， 其检测结果和通过恒温水浴锅进行RPA扩增反应的结果一致 ，该条件下发生的RPA扩增反应仍具有较高的灵敏度。
其检测速度快，反应时间短 ，检测方式多样化以及检测结果可视化等优点使得RPA技术在动植物病毒的检测方面得到了广泛应用。
但是在植物病原细菌方面的检测仅限于由植原体引起的病害，在植物病原真菌方面的检测更是鲜少报道。
其中 番茄细菌性叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、水稻细菌性谷枯病菌和白叶枯病菌等 的RPA检测体系被相继报道，但是没有用于尖孢镰刀菌西瓜专化型的RPA检测体系。
因此本研究旨在建立FON的RPA检测体系，以期为田间西瓜枯萎病的快速诊断和检测提供技术支持。
供试菌株和培养条件
供试菌株：所有菌株保存于滤纸片上，置于-80℃冰箱中长期保存，将保存的真菌于PDA平板上活化，置于25℃培养箱中培养7d，将长满平板的边缘菌丝转接到新的PDA平板上，置于25℃培养箱中培养7d。
目前没有可用于RPA引物和探针设计的软件或网站，因此按照RPA引物设计的原则：引物长度 一般在30～35nt，不要超过45nt。
引物避免出现发卡结构， GC含量最好在30%～70%，引物5’端尽量为G ，避免出现连续的C，3’端最好以G或C结尾。
引物扩增子的长度最好在150-300bp，不宜超过500bp，按照该原则在1.3中筛选得到的4个特异性基因片段的上下游各设计3条引物，根据正交组合每个片段可得到9对不同的引物组合。
按照RPA探针的设计原则：在上下游引物中间，找一段长为46-52nt的片段，在该片段互补序列的5’端用常用抗原FAM修饰。
在其3’端用C3-Spacer修饰， 5’端和3’端中间用四氢呋喃THF标记 ，作为探针的识别位点。
将提取得到的西瓜枯萎病菌基因组DNA进行梯度稀释，用筛选得到的特异性引物进行灵敏度的验证，所用FON基因组DNA浓度梯度依次为： 100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL ，每组试验重复3次。
RPA反应体系的建立
因得到的引物数量过多，考虑到反应成本问题， 所以首先用普通PCR反应对设计的引物进行初步筛选 ，PCR反应结束后再用琼脂糖凝胶电泳对试验结果进行检测。
其中C图所用引物只能从西瓜枯萎病菌基因组、香蕉枯萎病菌基因组和菊花枯萎病菌基因组中扩增出条带，且从香蕉枯萎病菌基因组中扩增出的条带相对扩增出的其他条带而言亮度较弱。
因此选择681-31-F/681-31-R作为初步筛选到的特异性引物。
结合DNA恒温快速扩增试剂盒进行RPA扩增，扩增产物取10μL稀释20倍之后进行胶体金试纸条检测， 剩余15μL扩增产物用试剂盒回收之后，进行琼脂糖凝胶电泳检测 。
用两种检测方法来验证该引物 在进行RPA扩增反应时的特异性，侧流层析试纸条结果 ，表明，以FON基因组DNA为模板的扩增产物在胶体金试纸条的质控线和检测线处均出现清晰的条带。
而以其他10种供试病原真菌基因组DNA为模板的扩增产物在胶体金试纸条上只显示一条质控线，表明681-31-F/681-31-R引物对FON的特异性较强。
琼脂糖凝胶电泳结果表明，以FON基因组DNA为模板的RPA扩增产物回收之后用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，能够看到清晰的条带大小约为189bp的条带。
其他10种供试病原真菌基因组DNA为模板的扩增产物回收之后无扩增条带的产生， 再次说明该引物对FON有良好的特异性。
为验证本研究中筛选的引物对全国其他地域FON分离株的效果，试验选取7个不同地域的FON分离株进行特异性检测，结果表明，引物681-31-F/681-31-R能够检测到来自全国7个不同地域的FON分离株。
将西瓜枯萎病菌基因组DNA进行梯度稀释， 使其浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL ，利用DNA恒温快速扩增试剂盒进行扩增，扩增产物分别进行侧流层析试纸条检测和琼脂糖凝胶电泳检测。
其中琼脂糖凝胶电泳试验结果表明建立的RPA检测体系的检测下限为100pg/μL，侧流层析试纸条检测结果表明建立的RPA检测体系的检测下限为1ng/μL，两者结果不完全一致。
分析原因可能是由于进行侧流层析试纸条检测时， 对扩增产物稀释20倍之后才进行上样，导致灵敏度出现些许降低。
为验证本研究中所建立的RPA检测体系在实际应用中的可行性和其在田间进行实际检测的效果，本次试验直接采用胶体金试纸条进行扩增结果的检测。
接种西瓜枯萎病菌后在植株显症之前随机选取4株西瓜植株 ，提取其基因组DNA，以未接种FON的西瓜植物组织基因组DNA为空白对照，利用DNA恒温快速扩增试剂盒进行RPA检测。
RPA扩增结束后将扩增产物稀释20倍， 取50μL稀释产物直接用胶体金试纸条进行反应结果的检测。
结果表明，以接种FON未显症的4株西瓜植物组织基因组DNA为模板的RPA扩增产物经试纸条检测后均出现2条条带，而以未接种FON的西瓜植物组织基因组DNA为模板的RPA扩增产物经试纸条检测后只出现一条质控线。
西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型FON侵染西瓜引起的病害 ，该病害发病面积广，发病速度快，对西瓜的产量影响极大。
目前没有可以彻底清除发病地块中西瓜枯萎病菌的方法，导致西瓜种植过程中的连作障碍逐年加重。
我国作为西瓜生产和消费的第一大国，西瓜种植过程中一旦发生西瓜枯萎病将导致极大的经济损失。
通过苗期管理、轮作和嫁接的方法防控西瓜枯萎病难度和成本高 ，难以进行大面积推广；培育抗病品种周期长且FON分化类型多，难以进行多位点抗性育种。
化学防治是指利用化学农药对植物病害进行防治的方法，该方法见效快，防效高，但存在对人畜不安全，环境污染大等问题。
生物防治是当下防治西瓜枯萎病的最佳选择之一 ，但生物防治见效慢，适用范围小且使用效果易受天气影响。
因此，建立西瓜枯萎病菌的快速检测技术对西瓜枯萎病的流行预测以及制定有针对性的防控策略具有重要的意义。
此项研究通过生物信息学分析筛选得到了FON的4个特异性片段并对其进行RPA引物的设计， 之后通过普通PCR扩增反应对引物进行特异性和灵敏度的筛选。
并用DNA恒温快速扩增试剂盒对其进行验证，得到对FON特异性和灵敏度较好的一对引物，利用该引物的扩增片段设计RPA探针。
对扩增效果较好的反向引物进行修饰， 再用DNA恒温快速扩增试剂盒进行扩增反应 ，扩增结束后取10μL扩增产物稀释20倍进行胶体金试纸条检测。
剩余15μL扩增产物用试剂盒回收，进行琼脂糖凝胶电泳检测，以筛选确定合适的探针，最后利用筛选得到的特异性引物和探针进行温室接种西瓜植株的RPA检测。
结果表明本研究中所建立的RPA检测体系能够从温室接种未显症的西瓜植株中检测到FON， 可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。
RPA未来的发展会更多的集中于现场检测和多重检测 ，多重检测有望通过一个RPA反应实现对多种病原物的检测。
