孤兒G蛋白偶聯受體84（GPR84）是一種與癌癥、炎癥和纖維化疾病相關的受體。牛津大學報道了G蛋白受體偏向性激動劑 DL-175 ，其透過Gai/cAMP和β-arrestin不同訊號通路傳導，但代謝迅速。本文主要從 DL-175 開始進行分子最佳化，經SAR分析發現萘基引入取代基可以提高代謝穩定性，在吡啶N-氧化物基團上引入5-羥基得到化合物 68（OX04528） 和 69（OX04529） ，將cAMP訊號傳導的效力增強3個數量級，低至皮摩爾。兩個化合物在濃度最高達到80μM條件對β-arrestin招募沒有影響。化合物 68 和 69 是一種具有開發潛力的GPR84偏向性激動劑，可進一步評價體內藥效活性。本篇文章主要介紹了化合物 68 和 69 發現和分子最佳化過程，可為類似專案結構最佳化提供寶貴經驗。
圖1. 化合物68和69發現和分子最佳化過程
G蛋白偶聯受體（GPCR）是由人類基因組編碼的最大膜蛋白家族，調節多種不同的生理過程。GPCR超家族受體對多種配體都有反應。其中，遊離脂肪酸（FFAs）是一種必需營養素，對於心血管、新陳代謝和炎癥相關的眾多生理過程具有影響。以FFA為內源性配體調節其功能的GPCR家族視為遊離脂肪酸受體（FFARs），包括中長鏈FFARs, 如GPR40（FFA1）和GPR120（FFA4）以及短鏈FFARs，GPR43（FFA2）和GPR41（FFA3）。
G蛋白偶聯受體84（GPR84），視為rhodopsin類A GPCRs和假定的第五脂肪酸受體是其中之一。GPR84透過綜合表達序列標簽數據庫搜尋的方法發現的，然後從GPR84編碼的人外周血嗜中性球中複制和表征。GPR84主要表達於骨髓細胞，包括單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、佛波酯啟用的外周血單核球和位於中樞神經系統的小膠質細胞。鏈長為9-14飽和中鏈脂肪酸（MCFAs）是GPR84的激動劑，參與Gai訊號傳導，透過抑制腺苷酸環化酶來減少環磷酸腺苷（cAMP）的產生。
然而，最有效的MCFA——癸酸 1 （Fig1）以及MCFA氧化代謝產物，3-羥基十二烷酸 2 僅表現出微摩爾效力，無法招募β-arrestin，這與GPR84仍是孤兒受體的觀點一致。淋巴細胞和脂肪細胞中GPR84 mRNA表達可以透過維生素D、炎癥刺激物如LPS、腫瘤壞死因子α（TNFα）和慢性低度炎癥顯著上調。體外合成的激動劑啟用GPR84會導致吞噬作用增強、免疫細胞遷移和細胞因子、趨化因子和其他炎癥因子分泌增加。GPR84激動劑已報道可增強脂肪細胞質膜相關蛋白（APMAP）缺陷癌細胞的吞噬作用，抑制脂毒性誘導的巨噬細胞過度啟用，引發細菌粘附增加，顯示出抗動脈粥樣硬化作用，並在線粒體代謝調節中發揮作用，表明GPR84的啟用可能是有益於癌癥、殺菌和代謝功能障礙。
內源性的GPR84配體尚不清楚，6-辛基胺基尿嘧啶 3 （ 6-OAU ）是第一個從化合物庫中篩選發現的合成激動劑。該化合物由一個極性投基團和親脂鏈組成的擬酸結構，是常用的陽性對照化合物，既能啟用G蛋白，又能招募β-arrestin。其衍生物 4 （ PSB-1584 ）在G蛋白和β-arrestin途徑中顯示出增強的活性。 Embelin 5 （Fig1）是一種可以啟用GPR84的天然產物，發現其具有鎮痛、抗腫瘤、抗炎、抗氧化和傷口愈合活性。透過對脂肪鏈進行修飾，化合物 6 對GPR84的啟用表現出更高的效力和更好的選擇性。基於160,000種化合物的高通量篩選來自中國國家化合物庫，發現化合物 7 （ ZQ-16 ）比化合物 6 更有效。經過SAR分析，發現化合物 8 （ LY-237 ）在鈣離子和cAMP實驗檢測中在hGPR84轉染的CHO細胞中比化合物 7 和 3 更有效。
尿嘧啶衍生物 9 和 10 （ PSB-16434 和 PSB-17365 ）報道對GPR84和G蛋白訊號傳導偏向具有增強的效力。最近有文獻報道了化合物 3 和 8 與GPR84結合冷凍電鏡結構，展現了GPR84啟用的蛋白結構基礎。在許多GPCR蛋白中，G蛋白和β-arrestin介導的訊號通路已被證明具有不同的生物醫學和生理作用，使得他們能夠將功能效應導向特定途徑。偏向激動劑可以辨識具有更高功效並減少脫靶副作用的化合物，開發偏向激動劑已成為一個日益活躍的研究領域。
牛津大學使用定量結構-活性關系（QSAR）模型進行虛擬篩選，進行初步的SAR分析得到了化合物 11 （ DL-175 ）。在檢測cAMP積累抑制的實驗測定中，顯示出與化合物 3 相當的效力。然而，在測定最高濃度為60 μM下，它對β-arrestin招募沒有任何影響，表明對G蛋白訊號傳導存在顯著偏向。與化合物 3 相比，化合物 11 不能促進M1極化的U937巨噬細胞的趨化性，表明GPR84驅動的吞噬作用和趨化作用可以分開，並且誘導較少趨化性的偏向激動劑可能潛在的減少體內副作用。
此外，化合物 7 可以誘導GPR84在兩個蘇胺酸殘基（Thr263/Thr264）上的磷酸化，而化合物 11 沒有，且在GPR84受體中引入Arg172Ala突變不影響化合物 11 的活性，同時化合物 7 的活性喪失，這表明它們可能具有不同的結合模式。 然而，在小鼠肝細胞代謝實驗中，化合物11會快速代謝（t1/2<10mins），導致其不能作為體內工具化合物。 由於GPR84體外和體內偏向訊號傳導的影響仍有待認識和理解，因此需要開發具有適合體內研究的藥代動力學特征的偏向激動劑。牛津大學對化合物 11 進行分子最佳化成合適的體內工具化合物，用於臨床前模型中GPR84疾病生理學研究。經系統的SAR分析，最終開發出具有適當選擇性和ADME的GPR84有效、高度G蛋白訊號偏向的激動劑 68（OX04528） 和 69（OX04529） 的體內研究。
分子最佳化圍繞GPR84偏向激動劑 11 的化學反應以形成適合體內研究的分子改造策略，牛津大學首先試圖了解化合物 11 的代謝傾向。11與小鼠肝微粒體（MLM）和小鼠肝細胞一起孵育表現出快速代謝，t1/2分別為13.8mins和小於10mins。化合物 11 與小鼠肝細胞一起孵育60分鐘，並使用LC-MS/MS對所得代謝物進行表征：檢測到代謝物中有76%顯示單氧化，其中8%形成葡萄糖醛酸結合物；12%的代謝物是二羥基化，其余的12%是未鑒定的代謝物。鑒於代謝物情況，推測氧化主要發生在萘基團，因為萘酚和二氫二醇的氧化代謝較為常見。根據SAR分析以及對化合物11代謝物的認識，該結構被分為三個區域（Fig2），即疏水尾部（區域C）、連線基團（區域B）和極性頭基團（區域A）分別最佳化。
C區SAR分析
最初對化合物 11 的C區進行結構修飾，首先解決代謝不穩定的問題，如表1所示。透過抑制CHO-hGPR84細胞中毛喉素誘導的（FSK誘導）cAMP產生來測量GPR84激動劑的效力（EC50和pEC50±SEM）。透過最佳化分子的親脂性來提高化合物的體外活性，還檢測了親脂配體效率（LLE）。去掉4-氯取代基或用鹵素、給電子基團或氫替換4-氯取代結果說明了對鹵素的偏好。化合物 16 和 17 的效力降低15至118倍， 說明平面且為芳香基團是優選片段 。與化合物 17 相比，化合物 18 的效力降低，說明需要芳香基團。
對氯苯基取代的化合物 19 與 11 相比，其效力降低110倍。盡管與 11 相比，化合物 16 和 19 效力降低，但在代謝穩定性研究實驗發現，由於對氯苯基取代有利於代謝穩定性的提升（ 19 ，MLM t1/2=59.6mins）， 這與之前假設一致，即代謝主要位點是萘基 。由於效力降低且不存在其它親水基團，結構改造的化合物沒有高於化合物 11 的LLE。所有活性化合物與陽性對照物（癸酸）在cAMP實驗中相比都是完全激動劑。全部化合物在β-arrestin實驗中都沒有活性（如表1），這說明 11 的衍生物在GPR84上具有一致的G蛋白訊號偏倚。 根據化合物19的實驗結果，進一步探索C去取代芳烴以維持代謝穩定性並增強效力。
進一步研究C區的苯基取代，設計並合成了對位取代衍生物（表2）。對位鹵代衍生物 20 和 21 的效力與化合物 19 相當，與萘系列一致。對位取代的化合物 22 和 23 表現出效力顯著降低，可能是由於氰基和硝基降低了芳烴電子雲密度不利於氫鍵受體形成，或降低了疏水性。鄰位取代的衍生物 24-29 效力降低或減弱。與化合物 25 和 31 相比，化合物 29 和 30 效力增加進一步強調了鹵素作為對位取代基團的重要性。
間位碘取代的化合物 32 在LLE增強的情況下，效力提高20倍，說明適當的間位取代衍生物的有可能增強效力。不同的間位取代衍生物（ 33-40 ）效力降低進一步了解空間效應和活性之間的關系。將鹵素從碘取代的 32 改為空間阻礙較少的溴 33 、氯 34 和氟 35 ，活性逐漸降低。隨著受阻的3-苯基取代36的效力顯著降低。而較小的3-甲基、3-甲氧基和3-乙基化合物活性表現為乙基>甲氧基>甲基。間位硝基取代的 38 沒有表現出活性，而3-環丙基取代的41效力顯著提升，但相比於 32 ，LLE略有下降，表明間位取代需要適當平衡空間位阻效應和分子親脂性。
然而，在MLM研究中，發現化合物41快速代謝（MLM t1/2=7.2min），這可能是由於環丙基先被氧化所致。4-Cl-3-CF3取代的 42 和3,5-diCF3-取代的 43 與化合物 19 相比顯示出效力增強，且化合物42表現出良好的代謝穩定性（MLM t1/2=49.9min）。與陽性對照癸酸相比，cAMP實驗中發現所有活性化合物都是完全激動劑，並且在招募β-arrestin沒有檢測到活性，這與化合物 11 的結果一致。
B區SAR分析
接下來牛津大學研究連線子部份（B區），以探討鏈長、雜原子的引入/去除以及所選官能團的耐受性的影響（表3）。
從化合物 44 、 45 和 11 相比較，很明顯，連線子的長度在3個原子時是最佳的。化合物 46 和 11 比較，說明另一個連線子不是必需的且可以用烷基連線子代替。但是，換成烷基連線子可能會降低LLE。與化合物 15 和 46 相比， 47 的效力下降20倍，表明引入羰基削弱效力。與化合物 19 相比，由於不同位置的醚鍵連線子 48 導致效力下降2倍。有趣的是，帶烷基連線子 49 和 19 相比，效力增加4倍。這與萘系列 46 不一致但顯示出具有保持效力和LLE的同時替代萘的潛力。
進一步替換 49 中X位為羰基得到化合物 50 ，效力降低2倍。透過改變對氯苯基衍生物上的位置（Fig3C），如碸 51 和羥基 53 效力減弱。與化合物 19 相比，氟和羰基使效力降低10倍以上。在化合物 55 的X位置引入胺基導致類似的效力，LLE高於化合物 19 ，但效力低於 49 。與陽性對照癸酸相比，cAMP實驗測定所有活性化合物都是全激動劑，並且在招募β-arrestin沒有檢測到活性。
N-氧化物吡啶的生物電子等排
開始探索A區SAR研究之前，首先探索了非等排體替代策略，透過醛氧化酶代謝來潛在地減少吡啶N-氧化物分解。由於結構相似，氫鍵受體相似，吡啶酮可以是吡啶N-氧化物的生物等排體。O-甲基保護的羥基吡啶 56 和 57 在cAMP實驗測定中沒有活性，可能是由於甲基取代阻斷氫鍵受體作用（表4）。取代的吡啶酮 58 在cAMP實驗測定中顯示完全激動活性，β-arrestin效力和LLE與化合物 11 相當，說明吡啶酮與吡啶N-氧化物具有類似的作用。4-取代吡啶酮 59 的效力降低了17倍，可能表明氫鍵供體N-H減弱效力。因此，將化合物 60 作為化合物 19 的生物等排體，比較代謝穩定性。 然而，與吡啶N-氧化物19相比，化合物60（MLM t1/2=11.7min）穩定性較差，說明吡啶酮部份是體內代謝穩定性差的主要來源。因此，沒有進一步研究吡啶酮，開始研究吡啶N-氧化物基團修飾作為替代方案。
A區SAR分析
A區研究重點是透過改變R1、R2和R3的取代來增強活性（表5）。用甲基或乙基（ 61 和 62 ）取代R2表現出中等至大幅的效力下降，說明該位置存在空間限制。相比化合 61 ，化合物 63 在R1引入甲基活性顯著降低，表明R1的取代是不可接受的。透過將醚連結子轉為烷基連線子，與化合物 11 相比，化合物 64 顯示出相當的效力，且LLE略有下降，這與Fig3的萘系列一致。然而，透過抑制cAMP水平，在R3引入羥基作為取代基，效力增加2000倍。與陽性對照分子癸酸相比，起到了黃曲黴素的作用，同時，在最高測試濃度（80μM）條件下，仍沒有表現出β-arrestin募集作用。註意到化合物 66 的A區與 6-OAU 和 PSB-16434 內的嘧啶二酮有一定的結構相似性，使得牛津大學推測額外的羥基是否可以起到氫鍵受體作用，類似於 6-OAU 和 PSB-16434 的嘧啶二酮互變異構形式與GRP84的結合模式。
然而，最重要的是，在R3（ 67 和 65 ）導致活性降低，表明R3增加新的氫鍵供體實際上可能是負責增強效力。這些實驗觀察結果可能表明化合物 66 分別與 ZQ-16 和 LY-237 的二羥基嘧啶和二羥基吡啶互變異構體更接近。化合物 66 的這種增強效力可能是由於與GPR84中的相鄰殘基（與Arg172）形成新的氫鍵，因為化合物 11 透過獨立於Arg172的機制啟動GPR84啟用，對於其它類似脂質配體至關重要。 隨著效力增強，化合物66的LLE增加到超過5，完全再藥物發現專案的可接受範圍內。
SAR總結
化合物 11 周圍不同的3個區域（Fig3）：區域A不能耐受位置1和位置2的取代，而位置3引入氫鍵供體使效力提高≥1000倍，發現3個原子接頭長度對於B區是最佳的；C區是主要的代謝位點，但透過用芳烴取代萘基團可以緩解。這導致活性喪失，可以透過位置5（Fig3，C區）上引入取代基並將Y更改為Cp（Fig3，B區）來緩解。
高效、有偏向且代謝穩定的激動劑設計
化合物 68 （ OX04528 ）和 69 （ OX04529 ）是透過將三個區域的主要發現合並在一起設計和合成的（表6）。
化合物 68 和 69 均表現出高效力和G蛋白訊號傳導偏差。一般認為，受體表達水平會影響基於細胞的測定中表觀效力的測量，較高的GPR84表達水平為同一配體提供較高的表觀效力值。為了避免這一潛在的混淆問題，牛津大學比較了化合物 68 和 69 在cAMP和β-arrestin招募測定的影響，以及偏倚程度不同的參考配體，比較相對效價值，其中包括 6-OAU 、 ZQ-16 和 PSB-16434 。在cAMP實驗測定中，效價排序為 68>69>ZQ-16>PSB-16434>6-OAU>11 。
在β-arrestin測定中， ZQ-16>6-OAU> PSB-16434>11=68=69 。與此前報道的配體相比，化合物 68 和 69 在cAMP抑制中表現出極大的改善活性（Fig4a和表2），而兩種配體在測試最高濃度下均為表現出β-arrestin募集（Fig4b）。這可能是由於與其他配體相比的不同結合模式，與之前觀察到 6-OAU 和 DL175 之間藥理學差異一致。這些差異需要用化合物 68 和 69 進行進一步研究。
體外ADME分析顯示化合物 68 和 69 在MLM中緩慢降解（t1/2=89min和105min）。比化合物 42 和 19 代謝更穩定，表明3位羥基也可能減慢吡啶N-氧化物的代謝。隨著效力增加3個對數級，化合物 68 和 69 均顯示出改善的LLE>5。
新GPR84激動劑的選擇性
為了確認化合物 68 和 69 誘導的cAMP產生的抑制是由GPR84介導的，對未轉染的CHO-K1親代細胞進行cAMP檢測，未檢測到cAMP的抑制（Fig5a）。根據先前發表的藥理學證據，化合物 11 的結合被認為與 6-OAU 和 MCFA 的結合位點重疊，盡管可能具有不同的結合模式，因為受體突變研究表明GPR84 Arg172 Ala突變消除了 MCFA 和 6-OAU 的相互作用，但化合物 11 沒有。化合物 11 在β-arrestin 募集激動劑和拮抗劑篩選試驗中顯示出 GPR84對168個人類GPCR的高選擇性。 MCFA 啟用GPR84表明 68 和 69 對脂質傳感器FFA1和FFA4可能存在潛在的脫靶效應。感應大麻素受體2（CB2）可被癸酸1啟用在微摩爾範圍內，因此對這三個 GPCR 進行了選擇性反篩選測試。用熒光成像酶標儀 (FLIPR) Ca2+ 測定（Fig5b-d） 68 和 69 ，顯示 FFA1、FFA4和CB2無活性。
體外細胞毒性
毒性是藥物開發中必須考慮的因素。因此，透過測量CHO-hGPR84細胞和CHO-K1細胞的乳酸去氫酶（LDH）釋放來檢查化合物 68 和 69 的細胞毒性。在所有測試濃度（高達30μM）下孵育20小時後，化合物 68 和 69 均未顯示出細胞毒性的證據。
體內藥代動力學研究
由於化合物 68 和 69 在體外測定中都表現出顯著增強的效力、訊號偏倚和改善的代謝穩定性，因此兩者都被用於體內PK分析。兩種化合物均具有口服生物利用度，並且分別具有58和53分鐘的適當體內半衰期（表7）。以10mg/kg口服給藥後，4小時後，兩種化合物在血漿中的總濃度約為10nM，遠高於細胞效力的測定值，支持它們進入體內功效研究（Fig6）。總而言之，這些數據表明這兩種化合物 68 和 69 將是有用的體內探針，值得進一步研究。
結論
強效GPR84偏向激動劑 68 和 69 的發現始於用4-氯苯基替代 11 中的對氯萘（C區，Fig2）導致效力降低100倍但代謝穩定性增強。區域的進一步最佳化導致了活性的一些恢復並保持了MLM的穩定性。嘗試用吡啶酮生物等排替代N-氧化物未能改善活性或代謝穩定性。對A區的SAR研究發現，與化合物 11 相比，添加α羥基可導致3個對數的效力增強，同時保留較高的訊號偏差，這透過其在β-arrestin招募測定中的無活性來證明。為了開發具有合適的藥物代謝和藥代動力學特征的候選藥物，設計並合成了化合物 68 和 69 。兩種工具化合物都顯示出極高的效力，EC50值分別為5.98和18.5pM，並且在β-arrestin測定中未檢測到活性（Fig4）。
此外，這些化合物對FFA1、FFA4和CB2受體具有選擇性。細胞暴露於 68 和 69 達到20小時並沒有導致LDH釋放，表明這些化合物在體外維持了細胞活力和低細胞毒性。化合物 68 和 69 的體外代謝研究顯示MLM穩定性增強。在小鼠PK研究中，化合物 68 和 69 的口服給藥顯示體內半衰期分別為58和53分鐘。然而，鑒於這兩種化合物的高活性，血漿中的總濃度在4h時高於各自的EC50，這為進一步的體內研究提供了機會。
參考來源
J. Med. Chem. 2024, 67, 110−137
來源：藥渡Cyber
