在上期 重编基因密码的进程（1） 中提到Peter Schultz团队通过向大肠杆菌内引入生物正交的tRNA/氨酰tRNA合成酶对，首次实现了体内非天然氨基酸的定点整合。目前Schultz等科学家已经可以通过这种方法将200种以上的非天然氨基酸整合到蛋白中，为研究蛋白结构和功能提供了极大便利，比如向蛋白中引入荧光标记或其它标签，或实施光笼（Photocaging）实验，实验蛋白被光敏感基团罩住而失活，特定光激发后蛋白恢复功能，可以用于研究生化过程及生物系统时空调控。
当生物体突破自然限制，拥有20种以上的氨基酸时会是什么样子呢?早期有研究表明E.coli在44℃以上的最简培养基中生长速度会明显下降，而添加蛋氨酸可以部分缓解，原因主要是参与蛋氨酸合成的一个酶 高丝氨酸 O-琥珀酰转移酶（MetA） 在40℃以上不稳定。Schultz团队将MetA催化中心外的绝大多数 位点（261/308）单个突变成琥珀终止密码子TAG构成了一个文库 ，将文库与包含 琥珀抑制 tRNA/aaRS对 （polyspecific amber nonsense suppressor tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) pair）的质粒 共转化 E. coli JW3973–1 (ΔmetA)突变株，注意琥珀抑制 tRNA/aaRS对与宿主tRNA/aaRS正交，将转化菌在液体最简培养基置于44℃培养20~40h后涂板，挑选单克隆并测序。最终发现F21TAG被替换为非天然氨基酸（对苯甲酰苯基）丙氨酸（pBzF）的 MetA突变体Tm值提升了21℃ （Tm，melting temperature表征蛋白稳定性）。将F21TAG metA突变体和相应的tRNA/aaRS对（pEVOL-pBzF）共同转化 E.coli ΔmetA 突变株并在含有1mM pBzF的培养基中，与野生型E.coli平行培养，可以看到突变菌株比野生菌株更快地生长。
通过引入非天然氨基酸 改变蛋白性能 的案例有很多，除了上述通过非天然氨基酸的引入提高了蛋白的热稳定性，其它还有对环肽，抗体，酶和噬菌体等的改造，用于提升亲和力，催化活性和适应性等。
高热稳定性MetA的筛选
除了在大肠杆菌体内重编基因密码，科学家在线虫，果蝇，植物甚至小鼠体内进行了测试。Chin与剑桥大学的神经科学家迈克尔·哈斯廷斯（Michael Hastings）及其同事利用扩展基因密码在 小鼠体内 构建了一个翻译调控开关。松果体上核（SCN）是哺乳动物的主要昼夜节律时钟，协调生理和行为的日常节律。昼夜节律的定时围绕着自持性的转录-翻译负反馈环路（TTFLs），其中CLOCK和BMAL1驱动负调节子Period和 Cryptochrome（Cry） 的表达。Cry1和Cry2的全局删除会使TTFL失效，导致下游行为的失律。作者将携带琥珀终止密码子Cry1蛋白构建至由Cry启动子控制的腺相关病毒（AAV）载体，将可以整合 炔基赖氨酸N6-[(2-丙炔氧基)羰基]-L-赖氨酸（AlkK） 的正交氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA构建到另一个AAV载体，其中氨酰-tRNA合成酶由 神经元特异性synapsin依赖的启动子 控制。 两种AAV通过脑内注射 传递给Cry缺失的小鼠SCN中，他们将其用作在小鼠脑细胞中打开和关闭基因的开关。由于小鼠无法自行合成AlkK，研究人员可以通过向啮齿动物的饮水中添加或移除AlkK来控制它们的昼夜节律。
Cry1表达的翻译调控开关调节小鼠昼夜节律
扩展基因密码在 医药领域 的应用也在积极开展中。蛋白与其它分子的作用通常是相对较弱的非共价结合，换成共价键结合有可能增强蛋白的效力，因此加州大学旧金山分校（UCSF）化学生物学家Wang Lei正在开展可以 与生物分子共价连接的蛋白药物 。在2020年，Wang Lei团队开发了 PERx（proximity-enabled reactivity） 治疗技术，隐藏在蛋白药物中的生物活性的非天然氨基酸在蛋白和细胞中稳定存在，但当蛋白药物与靶蛋白中某些天然氨基酸残基足够靠近时即可发生化学反应。作者早期发现 非天然氨基酸氟磺酸-L-酪氨酸（FSY） 可以与靠近的组氨酸，酪氨酸或赖氨酸发生点击化学 氟化硫交换反应（SuFEx） 。作者将FSY引入PD-1，一种免疫检查点蛋白，从而创造了一种 抗肿瘤药物 。通常，T细胞上的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1之间相互作用抑制了免疫反应，使肿瘤得以逃脱免疫监视。当作者将含有FSY的PD-1注射到植入人类癌细胞的小鼠体内时，蛋白与PD-L1形成了不可逆的共价键，阻断了PD-L1与T细胞表面PD-1互作，导致肿瘤收缩，效果与阻断型PD-L1抗体相当或更优。 Enlaza Therapeutics 从UCSF获取了这种共价治疗技术的独家授权，于 2022年12月15日完成6100万美元种子融资 后正式启动。Wang Lei在公司担任科学顾问。官网没有披露管线信息。
通过PERx技术开发共价蛋白药物
参考来源：
- Maywood, Elizabeth S.; Elliott, Thomas S.; Patton, Andrew P.; Krogager, Toke P.; Chesham, Johanna E.; Ernst, Russell J.; Beránek, Václav; Brancaccio, Marco; Chin, Jason W.; Hastings, Michael H. (2018). Translational switching of Cry1 protein expression confers reversible control of circadian behavior in arrhythmic Cry-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences, (), 201811438–. doi:10.1073/pnas.1811438115
- Li, Jack C.; Liu, Tao; Wang, Yan; Mehta, Angad P.; Schultz, Peter G. (2018). Enhancing Protein Stability with Genetically Encoded Noncanonical Amino Acids. Journal of the American Chemical Society, (), jacs.8b07157–. doi:10.1021/jacs.8b07157
- Li, Qingke; Chen, Qu; Klauser, Paul C.; Li, Mengyuan; Zheng, Feng; Wang, Nanxi; Li, Xiaoying; Zhang, Qianbing; Fu, Xuemei; Wang, Qian; Xu, Yang; Wang, Lei (2020). Developing Covalent Protein Drugs via Proximity-Enabled Reactive Therapeutics. Cell, (), S0092867420306231–. doi:10.1016/j.cell.2020.05.028
- Enlaza Therapeutics | Covalent Protein Biologics | Home (enlazatx.com)
