鹿角蕨多组学的昼夜动态为弱CAM光合作用提供了新的见解
发表单位： 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
发表时间： 2023年9月
发表期刊： Plant Communications
影响因子： 10.5/Q1
研究背景
景天酸代谢（CAM）具有很高的水分利用效率，被广泛认为是从 C3 光合作用进化而来。不同的植物系趋同地进化出了 CAM，但 C3 到 CAM 进化的分子机制仍有待明确。鹿角蕨为研究从 C3 光合作用向 CAM 光合作用过渡的分子变化提供了一个机会，因为该物种同时存在两种光合作用模式， 孢子叶（SL）和盖子叶（CL）分别进行 C3 和弱 CAM 光合作用。
研究结果
1.鹿角蕨弱 CAM 的生理和生化复杂性
作者通过比较二歧鹿角蕨的孢子叶（SL）和盖子叶（CL），以及典型的CAM和C3植物的气孔导度、净光合作用速率、苹果酸含量和δ13C值等重要光合作用指标（图1），发现weak CAM和strong CAM的气孔导度和净光合速率昼夜变化表现一致，但它们的苹果酸昼夜积累模式和δ13C值存在明显差异，这表明weak CAM途径光合作用的复杂性，同时也暗示了weak CAM在自然界的存在可能远比我们想象的普遍。
图1 二歧鹿角蕨的孢子叶（SL）和盖子叶（CL）光合特性
2.孢子叶（SL）和盖子叶（CL）多组学变化
作者在12小时/12小时的光/暗周期中培养植物，每3小时采集1次孢子叶（SL）和盖子叶（CL） ，进行转录组，蛋白质组，代谢组检测。来研究CAM和C3叶片之间的分子差异。GC-MS检出139中代谢物（图2A-C）。 聚类热图，PCA分析显示，相对于昼夜模式 ，初级代谢物在组织中显示差异性更大（图2B)。73个差异代谢物中，59个(80.8%)具有组织特异性效应，29个(39.7%)具有昼夜效应，27个(37.0%)存在组织特异性与昼夜效应的交互作用（图2D，E）。随后进行了转录组，蛋白质组分析，显示CL样本在PCA上有分离，说明CL样本在这两个层面上具有更强的时间调控性。
图2 组织模式和时间效应对二歧鹿角蕨的影响
3.孢子叶（SL）和盖子叶（CL）表现出不同的TCA循环昼夜动态
使用JTK_CYCLE方法研究了在这两种叶片类型中特定表现出昼夜循环节律的初级代谢物。73种代谢物，CLs中有19种表现节律性，SLs中只有5种。与C3叶片相比，CAM叶片CLs中有更多的代谢物受到时间调控。在CLs中，三羧酸(TCA)循环中的三种有机酸被检测为节律性代谢物:草乙酸、a-酮戊二酸和异柠檬酸。在SLs中，三种参与TCA循环的有机酸被鉴定为节律性代谢物:异柠檬酸、柠檬酸和琥珀酸。参与TCA循环的关键代谢物异柠檬酸在Cls和SLs中均显示出节律性（图3）。
在 代谢组 水平上，CLs 途径中所有七种定量代谢物的浓度都在光照期间达到峰值。相比之下，SLs 中所有七种代谢物的浓度都在黑暗期达到峰值。在 蛋白质组 水平上，与TCA循环相关的蛋白质，包括柠檬酸合成酶、乌头酸水解酶、异柠檬酸脱氢酶、a-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、富马酸水解酶和苹果酸脱氢酶的丰度在CLs的光照期或黎明期达到峰值，但在SLs的黑暗期达到峰值。参与 TCA 循环的基因的昼夜表达谱与代谢组和蛋白质组数据的结果一致。综合来看， 多组学数据表明 CAM 植物叶片在光照期间的 TCA 循环往往比在黑暗中更活跃。
图3 孢子叶（SL）和盖子叶（CL）中TCA循环的变化规律
4.二歧鹿角蕨CAM通路的动态及转录调控
作者研究了CLs中与CAM途径相关的基因表达和蛋白质丰度的昼夜动态。在 蛋白质组 中发现的所有七种核心CAM途径蛋白质在 CLs 和 SLs 中的昼夜动态均呈反向模式（图4A）。在具有 CAM 性能的CLs中，与夜间CO2同化和苹果酸产生有关的蛋白质的表达在黑暗中达到峰值。相比之下，参与苹果酸脱羧和 PEP 再生的蛋白质在光照下达到峰值，为卡尔文-本森循环产生CO2，并为重新进入CAM途径提供底物。与CAM 途径相关的基因转录组动态反映了蛋白质组分析。
二歧鹿角蕨中发现801个转录因子，在相同的基因组背景下，CAM途径中的基因在具有CAM表现的CLs和具有C3表现的SLs中表现出相反的昼夜表达模式，这表明基因表达的转录调控可能是CAM途径的关键因素之一。使用时间有序基因共表达网络（TO-GCN）方法，以C3表现型SLs为对照，构建了CAM途径的转录调控网络（TRN）。通过选择''C1+C2-'' GCN 集，即在 CLs 中具有正皮尔逊相关性而在 SLs 中具有负相关性的 TF基因对的重叠，确定了 786 个 TF、12 494 个蛋白编码基因和 36 155个TF-基因对。根据这些 "节点 "和 "边缘"，提取 CAM 通路中的蛋白编码基因及其共表达的 TFs 构建了假定的 TRN，确定了 39 个 TFs 作为调控二歧鹿角蕨CAM通路的候选基因（图4B）。其中，bHLH TF 家族的基因数量最多，这意味着它们对 CAM 通路的调控具有重要意义。在 TRN 中还发现了5个ERF、2 个MYB、2个ARF、1个Dof 和1个WRKY，这表明CAM通路的转录调控是一个由多个TF 家族协调的精细而复杂的生物过程。
图4 与CAM通路相关的蛋白质表达模式和转录调控网络
5.CLs气孔导度的时间动态和转录调控
CO2是与脱落酸(ABA)信号通路共同调控气孔运动的关键因子。PP2A和PP2C也通过调节OPEN STOMATA 1 (OST1)参与ABA感知复合物PYR1/PYL1/RCAR。作者发现，PP2A和PP2C在CLs和SLs之间呈现相反的表达模式。同时，在暗周期中，OST1的表达在CLs中增加直到21小时，而在SLs中保持不变。
气孔运动也由保卫细胞的膨胀变化驱动。呼吸爆发氧化酶同源物(RBOHD和RBOHF）在CLs中在黄昏时达到峰值，在夜间保持低表达，但在SLs中的表达模式相反，表明它们可能在调控气孔运动中发挥重要作用。这些结果表明，二歧鹿角蕨弱CAM叶片的倒挂昼夜模式是由与植物激素(如ABA)一致的离子和CO2浓度的守卫细胞感应触发的，这一假设有待于通过生理实验和对其他CAM物种的全面研究来进一步验证。
用TO-GCN构建的TRN显示，来自17个基因家族的26个TFs可能参与调控与CLs气孔运动相关的11个蛋白编码基因（图5B）。有趣的是，来自 bHLH 家族的 TFs 数量最多（26个），这与CAM通路中TFs的家族分布一致。这表明，一些调控 C3 植物气孔发育的 bHLHs 可能参与调控 CAM 物种的气孔运动。然而，在两个 bHLH TF 组之间没有发现重叠。相反，四个 TF，即 MYB（Pbi_DN37017c0g1）、ERF（Pbi_DN6647c0g1）、ARF（Pbi_DN450c1g1）和 Dof（Pbi_DN294c1g1）被确定为同时调控 CL 中气孔运动和 CAM 通路的潜在候选 TF。这些结果表明，二歧鹿角蕨的 CAM 通路与气孔运动之间可能存在部分转录调控重叠。
图5 二歧鹿角蕨气孔运动相关的基因表达模式和转录调控网络
6.CAM植物中PPCK介导的PEPC磷酸化的表达趋同
CAM光合作用区别于C3光合作用的一个独特特征是夜间二氧化碳同化。在CAM生理过程中，有四种蛋白质参与二氧化碳同化的酶促反应：b-CA、PPCK、PEPC 和 MDH。这四个基因的多个拷贝在黑夜周期中的表达量均高于白天。我们评估了这些基因在 CAM 物种间可能的趋同进化。b-CA 、PPCK、PEPC 和 MDH 基因的蛋白质序列在多个 CAM 物种之间没有发现趋同现象。 在所有 CAM 物种中，PEPC 的序列趋同并非遵循相同的路径。
整合了多个CAM物种中四个与CO2同化相关基因的已发表时间基因表达数据，以检验参与夜间CO2同化的基因在表达水平上是否经历了趋同进化。PPCK的表达水平在白天相对较低，在黑暗时期逐渐升高（图6）。PPCK在黑暗中使PEPC磷酸化，减少苹果酸介导的对PEPC活性的抑制，从而增加夜间的二氧化碳同化。这些结果表明， PPCK对PEPC的磷酸化可能是CAM植物夜间CO2同化趋同进化的关键步骤，凸显了基因表达调控在CAM途径进化中的重要意义。
图6 二氧化碳同化相关基因的表达趋同
迈维小结
在相同的遗传背景和环境条件下，作者研究了 分别进行 C3 和弱 CAM 光合作用 的二歧鹿角蕨 孢子叶（SL）和盖子叶（CL） 双态叶片的代谢组、蛋白质组和转录组的昼夜动态。结果显示。多组学数据表现出组织和昼夜效应。分析表明，与Sls相比，Cls中与能量产生途径（TCA 循环）、CAM 途径和气孔运动相关的生物化学在时间上重新布线。还证实了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(PPCK)在高度不同的CAM系中表现出基因表达的趋同性。基因调控网络分析确定了调控 CAM 通路和气孔运动的候选转录因子。总之，研究结果为弱CAM光合作用提供了新的见解，并为CAM生物工程提供了新的途径
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