前言
甘蓝型油菜是我国一种重要的油料作物，在油菜育种工作中，开花期是一个重要的农艺性状，适时开花直接影响到油菜的成熟时期，是保证产量稳定性的前提条件，油菜的开花期受温度和光周期等因素影响。
其中光周期是植物开花调控的关键因素，不同年份间，同一季节变化不大，随着生物技术的不断发展以及拟南芥中越来越多基因功能的挖掘，可以利用拟南芥中的基因信息对甘蓝型油菜中的同源基因进行功能解析。
本研究根据与拟南芥同源比对的结果挑选了BnaCO、BnaC3p7和BnaKHZI作为目的基因，CO是光周期途径中重要的转录调控因子，C3HI7和KHZI是拟南芥中CCH家族基因，这类家族在植物生长发育和逆境胁迫中有重要作用，分别构建这些基因的超表达载体转化拟南芥，以及构建多靶点CRISPR/Cas9载体转化甘蓝型油菜Westar品种，考察超表达株系和突变体后代表型。
甘蓝型油菜开花期研究
甘蓝型油菜属于异源四倍体，跟模式植物拟南芥相比，基因组更加复杂，基因功能研究也有一定的难度，对于甘蓝型油菜开花期相关的研究，已有许多关于开花基因数量性状位点的报道，随着分子标记和测序技术的发展，利用连锁分析和关联分析，越来越多的开花基因OTL被挖掘。
早在1997年，Osbom等对甘蓝型油菜、白菜和拟南芥的分离群体的开花相关QTL,定位区间进行比较,检测到2个OTL区段对应于拟南芥含FLOWERNNGLOCUSC等开花基因的区段。
推测荟薹属作物C和FRI等开花基因与拟南芥的同源基因具有相似功能，Zhao等利用欧洲品种和中国自交系品种为亲本构建DH群体以及SSR标记连锁图谱，对株高、开花期和成熟期共3个农艺性状进行OTL分析。
找到25个与拟南芥同源的开花候选基因，并且关联最显著的SNP位点位于拟南芥CO同源基因附近，距离只有13Kb，同样的，Wang等通过60KSNP芯片对448份甘蓝型油菜材料在4个不同环境下进行开花时间的全基因组关联分析。
发现40个开花时间显著关联位点，该研究进一步发现有20个开花期QT和224个开花期基因分别与24个和81个与生态型相关的区域重叠，揭示了甘蓝型油菜开花时间变异的一些关联标记性状和候选基因。
在甘蓝型油菜中鉴定出4个拟南芥FRI同源基因，Yi等进行关联分析发现，只有FRI参与了甘蓝型油菜开花调控,包括该同源基因在内的3个同源基因含有大量的多态性位点进行单倍型分析发现这3个同源基因在冬油菜中具有单倍型分布。
该研究首次为Bna43_FRI调控甘蓝型油菜开花提供分子基础，Wu等对991份甘蓝型油菜种质资源材料进行重测序，对FT和FLC的序列进行分析发现，同源基因的不同拷贝的编码区序列在不同生态群中保守，而其启动子区域多态性较为丰富。
2个基因在不同的生态型材料中表达水平有明显差异，说明这2个基因启动子区域的差异可能导致了不同生态型的开花差异，Chen等在甘蓝型油菜的2个近等基因系群体中图位克隆了FLC的2个同源基因BnFLC.A2和BFLC.C2,发现在BFLC.A2中有一个2.833Kb的插入,导致其失活并通过同源交换导入到C2染色体上，从而影响油菜的开花。
尽管基于关联分析和连锁分析鉴定到了大量开花期相关QTL，但由于甘蓝型油菜基因组的复杂性和开花期性状作为典型的数量性状，目前甘蓝型油菜开花相关基因克隆存在一定难度，相关的报道并不多，拟南芥与油菜亲缘关系近，并且有共同的祖先。
因此利用同源克隆的方法，从甘蓝型油菜中克隆同源基因是可行的，Robert等利用同源克隆的方法，从甘蓝型油菜中分离得到4个拟南芥CO同源基因，其中BnCOa1与拟南芥co-2突变体表型互补，Tadege等在甘蓝型油菜中分离了5个拟南芥同源FLC基因BnFLC1-5，转化拟南芥发现5个拷贝均能使拟南芥晚开花3周以上。
拟南芥CO基因的研究
CO基因是植物光周期途径中一个重要的转录调控因子，在整个植物开花调控网络中占有关键地位，关于拟南芥CO基因的功能研究在很早之前就有报道。
最初的研究表明，CO仅在长日照条件下对拟南芥开花有促进作用，在短日照下不参与开花调控，但近来有研究发现CO在短日照条件下能推迟拟南芥开花。
在拟南芥中，CO属于COL(CO-Like)家族，在拟南芥中还有其他16个基因成员，该家族基因编码的蛋白质在N端附近有1个或2个B-box结构，在C端有1个CCT结构域，CCT结构域编码约42-43个氨基酸，是非常重要的结构域。
CO的表达主要受光的2种方式调控，一是光受体直接调控CO的表达，二是光受体通过调控生物钟相关基因间接调控CO的表达，光受体直接调控CO的表达主要可以影响CO蛋白的稳定性，继而调控其表达规律，从而影响植物开花。
E3泛素连接酶,在长日照条件下,白天参与CO蛋白的降解，而蓝光受体FKF1能够抑制COP1从而保护CO蛋白不被降解，以此来调控开花，G!是生物钟相关基因，是光周期途径中另一重要基因，可调控CO基因的表达。
在傍晚，GI和FKF1蛋白复合物共同靶向降解Dof类转录因子，1个C0转录抑制蛋白，从而促进CO的表达，调控拟南芥的开花，长日照条件下，CO基因在光受体和生物钟相关基因的共同调控下，其表达量呈现节律性变化，并且COmRNA在傍晚和晚间出现高峰，而CO蛋白只在傍晚出现高峰，因为夜间有COP1和SPA1蛋白复合物进行降解。
CRISPR/Cas9相关研究
基因编辑技术是对基因组实现定点编辑的一项技术，是目前研究植物基因功能的一种理想手段，其原理是通过特异性核酸酶对目的DNA序列进行剪切，产生双链断裂,继而以非同源末端连接或者同源重组的方式对靶位点进行修复。
在修复的过程中靶位点产生插入、缺失或者替换等突变，近年来，基因编辑技术发展迅速，而CRISPR/CaS9基因编辑技术因为便于操作、成本低和效率高等优点，被广泛应用。
CRISPR/CIS系统一般存在于多数的细菌以及古生菌中，是机体形成的一种适应性免疫系统，可以降解外源入侵病毒从而保护自身不受侵害，其组成结构比较简单，包括tracrRNA、Cas基因、前导序列以及CRISPR位点。
CRISPR位点包括高度保守的重复序列和能够识别外源DNA的特异间隔序列，与特异间隔序列对应的外源DNA序列通常称为原间隔序列，一般在原间隔序列的3’端有几个保守的碱基序列，称为PAM元件，长度为2-5个碱基，在CRISPR/CaS9系统中，PAM序列为NGG，是剪切靶序列时的重要识别位点。
CRISPR/CIs系统的免疫过程大致可分为3个部分:首先是CRISPR间隔序列的获得，当噬菌体病毒或质粒等外源DNA入侵宿主时，宿主细胞通过PAM元件的识别，将外源基因组的原间隔序列整合到CRISPR位点上。
CRISPR基因座的表达，宿主的CRISPR序列经过前一个过程，整合了外源基因组的原间隔序列，然后在前导序列的调控下被转录成前体CRISPRRNA，之后在核酸内切酶的加工下，被剪切为成熟的crRNA。
最后是CRISPR/CaS系统介导的免疫，当同种外源DNA再次入侵宿主细胞时，cRNA能够识别外源基因组的原间隔序列，和Cas蛋白共同作用对其进行酶切裂解，从而保护自身细胞不受侵害。
CRISPR/Cas9突变类型及检测方法
CRISPR/Cas9导致的突变类型主要有插入、缺失和碱基替换，主要发生在PAM上游3bp处，这些突变类型中以单碱基插入为主，单碱基插入又以A或T碱基插入为主，还有单碱基到多碱基的插入或缺失，碱基替换概率最低。
影响CRISPR/Cas9编辑效率的因素有很多，Cas9基因密码子的优化、Cas9基因的启动子以及T-DNA插入植物基因组的位置都会影响Cas9的表达水平及活性，进而影响编辑效果。
其次还有靶位点的序列、GC含量、其与基因组可能形成的二级结构等也会影响编辑效果，还可能与植物材料本身有关，同一载体针对不同的植物材料可能编辑效果也会不一样，假如植物的修复能力强，那么突变效率可能就会降低。
影响CRISPR/Cas9编辑效率的因素有很多，Cas?基因密码子的优化、Cas9基因的启动子以及T-DNA插入植物基因组的位置都会影响Cas9的表达水平及活性，进而影响编辑效果。
其次还有靶位点的序列、GC含量、其与基因组可能形成的二级结构等也会影响编辑效果，还可能与植物材料本身有关，同一载体针对不同的植物材料可能编辑效果也会不一样，假如植物的修复能力强，那么突变效率可能就会降低。
目前经过改造的CRISPR/CaS9系统已被应用到许多植物的基因编辑研究中，在水稻中，通过CRISPR/Cas9系统对温敏雄性不育基因TMS5进行突变,在1年内培育出11个新的转基因无痕雄性不育品系，并且可以应用于2个水稻亚种的杂交育种，不仅加快了不育系的选育，而且也有利于杂种优势的利用。
结论
油菜是中国主要的油料作物，也是重要的经济作物，在油菜育种工作中，提高油菜产量一直是首要任务，而在育种工作中，开花期是一个非常重要的农艺性状，相对于其他农艺性状，适时开花将直接影响到油菜的成熟时期，是保证产量稳定性的前提条件，油菜的开花期主要受温度和光周期等因素影响，相对于温度，光周期是一个较稳定的气候因子，不同年度的变化不大。
油菜通过响应光周期改变生育期可以达到稳产的效果，由于甘蓝型油菜基因组的复杂性，图位克隆一个开花期基因受到限制，因此更多的研究是依据拟南芥中的信息，通过同源克降法对开花基因进行分析。
本研究依据拟南芥中的信息，挑选了甘蓝型油菜基因BnaCO、BnaC3p7和BnaK71Z!作为靶基因，利用CRISPR技术在甘蓝型油菜中进行基因定点编辑，并构建各基因每个拷贝的超表达载体转化拟南芥，初步探索甘蓝型油菜中这些基因的功能，同时创造甘蓝型油菜相关基因突变体材料，为更进一步的研究提供良好基础。
