在上期 重編基因密碼的行程（1） 中提到Peter Schultz團隊透過向大腸桿菌內引入生物正交的tRNA/氨酰tRNA合成酶對，首次實作了體內非天然胺基酸的定點整合。目前Schultz等科學家已經可以透過這種方法將200種以上的非天然胺基酸整合到蛋白中，為研究蛋白結構和功能提供了極大便利，比如向蛋白中引入熒光標記或其它標簽，或實施光籠（Photocaging）實驗，實驗蛋白被光敏感基團罩住而失活，特定光激發後蛋白恢復功能，可以用於研究生化過程及生物系統時空調控。
當生物體突破自然限制，擁有20種以上的胺基酸時會是什麽樣子呢?早期有研究表明E.coli在44℃以上的最簡培養基中生長速度會明顯下降，而添加蛋胺酸可以部份緩解，原因主要是參與蛋胺酸合成的一個酶 高絲胺酸 O-琥珀酰轉移酶（MetA） 在40℃以上不穩定。Schultz團隊將MetA催化中心外的絕大多數 位點（261/308）單個突變成琥珀終止密碼子TAG構成了一個文庫 ，將文庫與包含 琥珀抑制 tRNA/aaRS對 （polyspecific amber nonsense suppressor tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) pair）的質體 共轉化 E. coli JW3973–1 (ΔmetA)突變株，註意琥珀抑制 tRNA/aaRS對與宿主tRNA/aaRS正交，將轉化菌在液體最簡培養基置於44℃培養20~40h後塗板，挑選單複制並測序。最終發現F21TAG被替換為非天然胺基酸（對苯甲酰苯基）丙胺酸（pBzF）的 MetA突變體Tm值提升了21℃ （Tm，melting temperature表征蛋白穩定性）。將F21TAG metA突變體和相應的tRNA/aaRS對（pEVOL-pBzF）共同轉化 E.coli ΔmetA 突變株並在含有1mM pBzF的培養基中，與野生型E.coli平行培養，可以看到突變菌株比野生菌株更快地生長。
透過引入非天然胺基酸 改變蛋白效能 的案例有很多，除了上述透過非天然胺基酸的引入提高了蛋白的熱穩定性，其它還有對環肽，抗體，酶和噬菌體等的改造，用於提升親和力，催化活性和適應力等。
高熱穩定性MetA的篩選
除了在大腸桿菌體內重編基因密碼，科學家線上蟲，果蠅，植物甚至小鼠體內進行了測試。Chin與劍橋大學的神經科學家麥可·哈斯廷斯（Michael Hastings）及其同事利用擴充套件基因密碼在 小鼠體內 構建了一個轉譯調控開關。松果體上核（SCN）是哺乳動物的主要晝夜節律時鐘，協調生理和行為的日常節律。晝夜節律的定時圍繞著自持性的轉錄-轉譯負反饋環路（TTFLs），其中CLOCK和BMAL1驅動負調節子Period和 Cryptochrome（Cry） 的表達。Cry1和Cry2的全域刪除會使TTFL失效，導致下遊行為的失律。作者將攜帶琥珀終止密碼子Cry1蛋白構建至由Cry啟動子控制的腺相關病毒（AAV）載體，將可以整合 炔基賴胺酸N6-[(2-丙炔氧基)羰基]-L-賴胺酸（AlkK） 的正交氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA構建到另一個AAV載體，其中氨酰-tRNA合成酶由 神經元特異性synapsin依賴的啟動子 控制。 兩種AAV透過腦內註射 傳遞給Cry缺失的小鼠SCN中，他們將其用作在小鼠腦細胞中開啟和關閉基因的開關。由於小鼠無法自行合成AlkK，研究人員可以透過向嚙齒動物的飲水中添加或移除AlkK來控制它們的晝夜節律。
Cry1表達的轉譯調控開關調節小鼠晝夜節律
擴充套件基因密碼在 醫藥領域 的套用也在積極開展中。蛋白與其它分子的作用通常是相對較弱的非共價結合，換成共價鍵結合有可能增強蛋白的效力，因此加州大學舊金山分校（UCSF）化學生物學家Wang Lei正在開展可以 與生物分子共價連線的蛋白藥物 。在2020年，Wang Lei團隊開發了 PERx（proximity-enabled reactivity） 治療技術，隱藏在蛋白藥物中的生物活性的非天然胺基酸在蛋白和細胞中穩定存在，但當蛋白藥物與靶蛋白中某些天然胺基酸殘基足夠靠近時即可發生化學反應。作者早期發現 非天然胺基酸氟磺酸-L-酪胺酸（FSY） 可以與靠近的組胺酸，酪胺酸或賴胺酸發生點選化學 氟化硫交換反應（SuFEx） 。作者將FSY引入PD-1，一種免疫檢查點蛋白，從而創造了一種 抗腫瘤藥物 。通常，T細胞上的PD-1與腫瘤細胞上的PD-L1之間交互作用抑制了免疫反應，使腫瘤得以逃脫免疫監視。當作者將含有FSY的PD-1註射到植入人類癌細胞的小鼠體內時，蛋白與PD-L1形成了不可逆的共價鍵，阻斷了PD-L1與T細胞表面PD-1互作，導致腫瘤收縮，效果與阻斷型PD-L1抗體相當或更優。 Enlaza Therapeutics 從UCSF獲取了這種共價治療技術的獨家授權，於 2022年12月15日完成6100萬美元種子融資 後正式啟動。Wang Lei在公司擔任科學顧問。官網沒有披露管線資訊。
透過PERx技術開發共價蛋白藥物
參考來源：
- Maywood, Elizabeth S.; Elliott, Thomas S.; Patton, Andrew P.; Krogager, Toke P.; Chesham, Johanna E.; Ernst, Russell J.; Beránek, Václav; Brancaccio, Marco; Chin, Jason W.; Hastings, Michael H. (2018). Translational switching of Cry1 protein expression confers reversible control of circadian behavior in arrhythmic Cry-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences, (), 201811438–. doi:10.1073/pnas.1811438115
- Li, Jack C.; Liu, Tao; Wang, Yan; Mehta, Angad P.; Schultz, Peter G. (2018). Enhancing Protein Stability with Genetically Encoded Noncanonical Amino Acids. Journal of the American Chemical Society, (), jacs.8b07157–. doi:10.1021/jacs.8b07157
- Li, Qingke; Chen, Qu; Klauser, Paul C.; Li, Mengyuan; Zheng, Feng; Wang, Nanxi; Li, Xiaoying; Zhang, Qianbing; Fu, Xuemei; Wang, Qian; Xu, Yang; Wang, Lei (2020). Developing Covalent Protein Drugs via Proximity-Enabled Reactive Therapeutics. Cell, (), S0092867420306231–. doi:10.1016/j.cell.2020.05.028
- Enlaza Therapeutics | Covalent Protein Biologics | Home (enlazatx.com)
