治療性寡核苷酸代表了目前制藥行業的新突破。然而，對於寡核苷酸的表征分析來說，使用離子對反相色譜分析（IP-RPLC）是一個十分有挑戰的分析方法。寡核苷酸是透過逐步添加核苷酸的固相合成方式被生產出來的。因此，合成中產生的n-1和n+1雜質是必須要被表征出來，而且這表征的需要透過有效的方法開發來得到最佳化的結果。之後，此最佳化後的分析方法還可能需要對此寡核苷酸降解後的雜質進行定性和定量。
硫代磷酸酯寡核苷酸的分析代表了一個獨特的分析挑戰。 這些寡核苷酸的特點是用硫基團取代一個或者多個硫酸二酯骨架的非僑聯氧。盡管這個修飾能是寡核苷酸更穩定（使其產生：核酸酶抗性）以及提高了寡核苷酸的有效性，但是從分析上講，其分離和表征會更加困難。硫代磷酸鹽修飾後使寡核苷酸出現了立體異構體，由於此修飾細微地改變了寡核苷酸的物理化學性質，在使用常規的離子對反相色譜分析時，可能會導致峰寬變寬。日後，氧化硫代基團的定性和定量是會更為重要，而且這種分離可能會被高度依賴使用。對標準雜質n-1, n-2 的分離是固相合成寡核苷酸生產中必要的工序。此套用，我們透過對 22mer DNA 硫代磷酸酯的色譜分離來表現出此分離結果對後續的質譜表征有多重要。值得註意的是，此套用結果展示出被分離出來的n-1雜質 但也可能是我們所謂的PS/PO 氧化變異體。
圖1展示了22mer 硫代磷酸酯的分離結果。此紫外色譜圖展示在主峰前有兩個被提前洗脫下來的雜質，並標示為1號峰和2號峰。圖2則凸顯出主峰在使用TOF質譜後的全掃描Deconvolution Spectrum (解摺積質譜圖)。對於硫代磷酸酯DNA來說，這兩個被提前洗脫下來的雜質應該就是n-1和n-2的合成失敗序列，但是，他們也有可能是被氧化後的寡核苷酸變異體。
雜質1的Deconvolution Spectrum (解摺積質譜圖)（圖3a）對此定性為被氧化後的變異體。因此，可能有一些真正的n-1雜質與此變異體被同時洗脫下來形成峰重疊。圖3b展示了n-1和n-2雜質。此解摺積質譜圖表明了當與主峰品質對比時，一個品質為329Da的delta片段很有可能就是我們的目標序列所缺少的一個鳥苷殘基。之後對其他提早洗脫下來的雜質峰可能是其他失敗的短序列，但是在對其的質譜定性中由於未能產生足夠的光譜資訊解摺積未能對其進行表征。
綜上所述
此套用，我們展示了bioZen™ 2.6µm Oligo 色譜柱對DNA硫代磷酸酯雜質的分離能力，並使用質譜來對PS/PO和n-1雜質來進行定性。雖然透過對液相方法的最佳化可以進一步提高對雜質的分離，但是此套用也 證明了色譜柱效能在硫代磷酸化後的寡核苷酸雜質分析中的重要性 。
液相色譜條件:
色譜柱： bioZen™ 2.6 µm Oligo
規格： 150 x 2.1 mm
產品貨號： 00F-4700-AN
流動相：
A：100 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液
B：100 mM HFIP, 4 mM TEA甲醇溶液
梯度： 5-30 % B 於14分鐘內
流速： 0.3 mL/min
進樣量： 1 µL
溫度： 60 °C
檢測器：
UV @ 260 nm (圖1)
TOF-MS （圖2，3）
樣品： 22mer DNA 硫代磷酸酯
圖1：DNA 硫代磷酸酯雜質的表征
圖2：全掃描，Deconvolution Spectrum
(解摺積質譜圖)，主峰
圖3：Deconvolution Spectra
(解摺積質譜圖)，雜質峰
