前言：间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡（EV）是调节周围组织微环境的重要信号分子，内含多种信号物质，如信号蛋白、miRNA、RNA和DNA等。近年来，EV在抗衰和临床治疗中表现出显著效果，而且可以避免干细胞治疗可能引发的炎症反应、血管堵塞和疾病传播的风险，备受业界青睐。但如何获取高质量的EV是临床应用和产业化生产中亟需突破的瓶颈问题，值得深入探究。
传统获取MSCs-EVs的主要方法是血清饥饿培养（SC），但SC可能存在减缓细胞增殖、诱导细胞凋亡和囊泡质量不高等局限，减弱EVs的治疗效果。因此， 科研人员提出了一种连续营养供应培养（CC）的新策略来获取EVs，通过使用化学成分确定的培养基持续给MSCs提供各种营养物质和生长因子，改善EVs的生长条件。 通过与SC策略比较，发现CC策略可以有效地抑制MSCs的自噬和凋亡，提高EVs产量；通过小鼠UVB光老化实验，证明CC-EVs可促进细胞增殖，抑制慢性炎症反应，抗衰老作用更佳。
1.CC策略带来高产量、高质量的EVs
本研究CC策略采用Regenα-Geek的UltraMedia®无血清培养基，SC策略则选择Gibco的DMEM/F12培养基。脐带来源的组织长出原代MSCs后，置于含有5％CO2的培养箱中于37℃中传代培养，并于细胞融合至80%时获取细胞上清液，采用超速离心法收集EVs（图1a）。通过电镜发现，颗粒呈圆形具有双层膜结构（图1b），尺寸多数为30-150 nm（图1c），另外，蛋白质印迹法确认这些颗粒存在典型外泌体标记物（图1d），最终确认收集到的颗粒为MSCs来源的EV。在同体积细胞上清液和分离方法下，CC-EVs的蛋白质含量明显较高（图1e）。另外，每个CC-MSC衍生的EVs数量约为2.4 × 105个颗粒，约为SC-MSC的1.4倍（图1f）。 CC-EVs的浓度约为1.4×1012个粒子/mL，产量显著提高，特别在30–150nm尺寸范围内，其数量差异最明显（图1g/h）。
图1：CC-EVs和SC-EVs的表征及产量情况
探究CC策略促进EVs形成的机制，首先检测MSCs的状态差异。CC-MSCs自噬标志物LC3 II（图2a/b）和凋亡重要标志物PARP（图2a/c）表达较SC策略均降低；流式细胞术结果显示，CC-MSCs总细胞凋亡率与SC-MSCs相比下降了2.85%（图2d）。其次，对参与EVs形成与释放的蛋白质进行了分析，发现CC策略可上调内吞体分选转运复合体（ESCRT）的重要蛋白表达，如HRS和TSG101，并加速MSCs的膜转运和EVs的形成，此外，CC-MSCs还表达更高水平的Rab27a和Rab27b蛋白（图2e/f/g）， 表明CC策略刺激Rab27蛋白的合成，以加速EVs前体向质膜（PM）转运。
图2：CC-MSCs和SC-MSCs的状态差异
最后，对细胞膜融合过程进行探讨。CC-MSCs膜表面的四跨膜蛋白（CD81、CD9和CD63）强阳性细胞百分比更低（图3a/b），胞内四跨膜蛋白的含量更高（图3c/d），证明CC-MSCs有更多含有四跨膜蛋白的PM被内吞形成EVs前体。通过电镜捕获的图像可看出， CC-MSCs内的多囊泡体（MVE）数量多且形态更加成熟 （图3e/f）。
图3：CC-MSCs和SC-MSCs的膜融合分析
由此可见，CC策略可以抑制MSCs的自噬和凋亡状态，上调EVs相关膜转运蛋白的表达，加速MSCs内小分子信号物质的转运和对外释放，促进MSCs释放更多的EVs。
2.CC策略来源的EVs具有更强的抗衰老能力
UVB光损伤的皮肤修复主要涉及人上皮成纤维细胞（HEF）的再生和迁移。将HEFs与红色荧光示踪剂PKp6标记的EVs孵育24小时后，检测到HEFs核周围含有红色荧光颗粒（图4a）。CCK-8法显示CC-EVs改善光损伤的细胞增殖的效果更好（图4b），并采用BrdU ELISA试验再次验证，CC-EVs促进衰老的HEFs进入S期合成DNA，表现出更强的增殖能力（图4c）。划痕愈合测试显示，用CC-EVs处理老化细胞，其伤口愈合速度更快（图4d/e）。
图4：EVs对HEFs的再生和迁移影响
β-半乳糖苷酶（β-gal）染色显示，UVB照射诱导HEFs衰老（图5a）。EVs与衰老HEFs 共培养48小时后，细胞中的β-gal活性显著降低（图5b），导致胶原蛋白和弹性蛋白分解的基质金属蛋白酶（MMP1）表达下调（图5c），I型胶原合成增加（图5d），并且衰老细胞中p53的表达水平降低（图5e/f），受损的DNA得到修复。 这说明EVs具备抗衰能力且CC-EVs表现更佳。
图5：EVs改善HEFs的衰老状态
动物实验中，光损伤的KM小鼠上皮明显增厚粗糙，真皮纤维分布紊乱，皮肤附属器减少，经CC-EVs和SC- EVs治疗后皮肤均变得明显光滑，晒伤瘢痕得到有效修复（图6a/b）。Masson染色显示，CC-EVs治疗组的小鼠上皮厚度显著减少，胶原纤维再生，皮肤附属器再生并均匀排列（图6c/d）。为研究EVs在皮肤老化和胶原再生方面的分子机制，对皮肤蛋白质样品进行了分析，结果发现，CC-EVs显著抑制组织中MMP1合成，下调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的表达，激活NF-κB信号转导通路，减轻慢性炎症反应。此外，CC-EVs显著上调转化生长因子（TGF-β）的表达，促进皮肤组织中I型胶原蛋白（COL I）再生（图6e/f）。
图6：CC-EVs和SC- EVs在KM小鼠实验中的表现
miRNA在许多生理和病理状态的调控中发挥关键作用。对CC-EVs与SC- EVs的miRNA进行多方位分析比较：主成分分析（PCA）因子显示，PC1和PC2清楚地分离两组EVs的miRNA表达谱（图7a）；Venn图显示CC-EVs有663个miRNA，SC- EVs有552个miRNA（图7b）；通过热图揭示两组EVs的miRNA差异情况，共有125个miRNA表达显著差异，55个miRNA在差异倍数分析显示CC-EVs中有46个上调（83.6%），9个下调（17.4%）（图7c/e）。 由此可见，CC-EVs与SC- EVs存在差异表达的miRNA。
图7：CC-EVs与SC- EVs的miRNA分析
另外，miRNA相互作用网络图（图7d）中显示，CC-EVs中有多个miRNA靶向NF-κB信号通路下调衰老相关因子MMP1和β-gal；同时，miR-493等作用于靶基因TNF-α38，抑制NF-κB信号通路，下调核内炎症因子的转录，降低机体氧化应激水平。 结果表明，CC策略可以改变细胞囊泡携带的信号物质，使EVs含有更多的抗衰老因子，并抑制NF-κB信号通路激活引起的慢性炎症（图7f）。
相关研究内容以 Continuous nutrient supply culture strategy controls multivesicular endosomes pathway and anti-photo-aging miRNA cargo loading of extracellular vesicles 为题发表在杂志 Journal of Tissue Engineering (JTE) 。研究者希望通过优化EVs培养策略来缩短获取MSCs上清液的时间和降低成本，为大规模生产EVs提供方向，推进EVs在动物实验以及临床治疗中的应用。
