1997年，英國倫敦皇家自由醫院醫學院的Ling和 Harrison發表了一項題為「Production of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in transfected cells is independent of surface antigen synthesis」的文章[1]。
在該研究中，他們首先構建了支持HBV DNA復制的construct質體，隨後又以此為基礎構建了轉譯起始密碼子（ATG）突變（圖中對應標記為ds1、ds2和ds）的分別缺失L-、M-和S-HBs蛋白的表達質體，並轉染HepG2細胞。采用類似hirt的技術流程選擇性地提取制備細胞核DNA，然後用p32標記單鏈DNA探針做Southern Blot。結果見下圖（有修改）。首先是這個結果再次支持了前期有關滯後合成的HBV rcDNA正鏈的不完整（訊號弱）；再就是間接地提示了核衣殼能夠將rcDNA和dslDNA帶入細胞核。此外，我們還可以額外地註意到：缺了L-、M-HBs蛋白表達的constructs相較於野生型及S-HBs蛋白表達缺失有更高的rcDNA、dslDNA和更多的以單鏈形式存在的（single strand，ss）復制中間體。考慮到該研究中作者的富集細胞核DNA步驟，這可能是最早提示rcDNA和dslDNA可以在感染細胞胞核富集的證據。
盡管作者僅是透過分別將L-、M-和S-HBs的轉譯起始密碼子（ATG）突變使之分別不表達，並利用Sourthern blot顯示cccDNA量，然而作者在討論中卻聲稱「至少在我們的系統中，各種形式的HBV表面蛋白對細胞內來源的cccDNA積累的任何影響都可以忽略不計」似有不妥。因為我們在未經ApaI酶切的ds1、ds2和ds泳道看到了肉眼可見的cccDNA條帶的增強、以及ApaI酶切後由環狀cccDNA形成的線性的3.2kb DNA (L)同樣增強。
事後諸葛地以今天的知識再看這張圖，這樣的改變還是最好不要視而不見。實際上，就在該文發表前的1990年，新墨西哥州立大學MINSHU YU實驗室的JESSE SUMMERS等利用DHBV感染模型發表的研究就顯示：與野生型或僅S蛋白S/S蛋白缺失突變相比，前S缺失突變可使cccDNA顯著積累，提示加速了rcDNA向cccDNA的轉換（下圖A）。並且，805C、862A、910A、1165A和1S等影響S/S蛋白功能的點突變也會導致有活性的cccDNA的積累（下圖B，有修改）[2]。
實際上在此文發表前，人們已經確認了在core蛋白富含精胺酸的羧基端是帶有核定位訊號的[3] 。1994年，中國台灣地區廖運樊的實驗室在BBRC發文，報導了在COS-7細胞中單獨表達時主要為核定位的core蛋白在共表達病毒膜蛋白L-HBs，而非S-HBs時將與之共定位於細胞質中[4]。隨後他們又進一步證實：HBV core蛋白羧基端第三個SPRRR基序上單個絲胺酸殘基的取代都會顯著增強該蛋白的核定位，並且這種突變使L-HBs對其核定位抑制作用的消失[5]。
寫在最後
如此我們不禁要問，L-HBs如此強行把core蛋白拉入或滯留於細胞質中，由其構成的核衣殼如何入核釋放rcDNA並隨後轉換為cccDNA呢? 如果我們回想一下前些日子西班牙吉利德Aggarwal等發在Hepatology Report上的多色組化結果（見下圖，有修改）[6]，特別是在HBeAg陰性患者肝組織中極少觀察到HBsAg及core蛋白雙染色陽性的感染肝細胞，或許我們真的可以認為：阻止了core蛋白入核的L-HBs的存在真的不利於rcDNA到cccDNA的內迴圈。但是，core蛋白染色陽性代表和反映了cccDNA的存在並具有轉錄活性。此情此景下，它是如何選擇性地沈默HBsAg的表達？對此目前並無明晰的答案。由於這涉及到了慢性HBV感染的維持和隱匿性HBV感染（OBI）的發生機制，更與不同疾病階段慢性乙肝的有效治療靶點選擇有關，這無疑將是一個值得探究的問題。
文獻來源：
[1]Ling R, Harrison TJ. Production of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in transfected cells is independent of surface antigen synthesis. J Gen Virol. 1997 Jun;78 ( Pt 6):1463-7. doi: 10.1099/0022-1317-78-6-1463. PMID: 9191944.
[2]Summers J, Smith PM, Huang MJ, Yu MS. Morphogenetic and regulatory effects of mutations in the envelope proteins of an avian hepadnavirus. J Virol. 1991 Mar;65(3):1310-7. doi: 10.1128/JVI.65.3.1310-1317.1991. PMID: 1995945; PMCID: PMC239906
[3]Eckhardt SG, Milich DR, McLachlan A. Hepatitis B virus core antigen has two nuclear localization sequences in the arginine-rich carboxyl terminus. J Virol. 1991 Feb;65(2):575-82. doi: 10.1128/JVI.65.2.575-582.1991. PMID: 1987370; PMCID: PMC239794
[4]Yeh CT, Ou JH, Chu CM, Liaw YF. Alteration of the subcellular localization of hepatitis B virus core protein by large but not small surface proteins. Biochem Biophys Res Commun. 1994 Sep 15;203(2):1348-54. doi: 10.1006/bbrc.1994.2330. PMID: 8093050.
[5]Yeh CT, Chu CM, Liaw YF. A single serine mutation on the nuclear localization signal of hepatitis B virus core protein abolishes the inhibition of nuclear transport by surface proteins. Biochem Biophys Res Commun. 1995 Aug 24;213(3):1068-74. doi: 10.1006/bbrc.1995.2236. PMID: 7654223
[6]Aggarwal A, Odorizzi PM, Brodbeck J, van Buuren N, Moon C, Chang S, Adona M, Suthram S, Suri V, Trowe T, Turner S, Marcellin P, Buti M, Gaggar A, Fletcher SP, Diehl L, Feierbach B, Balsitis S. Intrahepatic quantification of HBV antigens in chronic hepatitis B reveals heterogeneity and treatment-mediated reductions in HBV core-positive cells. JHEP Rep. 2022 Dec 26;5(4):100664. doi: 10.1016/j.jhepr.2022.100664. PMID: 36908748; PMCID: PMC9996321
來源：片警實驗室
