前言
核盤菌是一種寄主植物和範圍廣泛的病原真菌,油菜菌核病便是該病原真菌引起的主要病害之一，油菜菌核病會導致植株減產作物質素下降乃至壞死，嚴重影響中國長江中下遊油菜主產地區的產業發展，研究核盤菌的分子致病機制可以為菌核病的綠色防治和抗病作物育種提供理論依據，
BTB，蛋白是一種廣泛真核生物中的超蛋白家族中的蛋白，BTB，蛋白在人體以及動物的研究中被報道地較多，在植物和真菌中的研究相對比較滯後。
研究報道植物BTB，蛋白家族基因參與植物抗逆性、抗病性、泛素化、離子通道、細胞降解及迴圈調控過程，在真菌中，有研究發現，BTB，蛋白在與毒素合成、蛋白互作調控致病力相關，目前，核盤菌的含有，BTB，結構域的基因功能未知，是值得研究的一個課題，
本實驗亦篩選出一個含有，BTB，結構域的基因,命名為，SSBTB1.生物資訊學預測Ssbtb1，蛋白屬於，BTB/POZ，家族，含有，Kelch，重復元件，主要參與細胞調控相關，本實驗利用分割標記法以及子囊孢子單孢分離純化法順利獲得純合的SsBTBI基因剔除菌株。
並透過農桿菌轉化法成功獲得基因剔除回補菌株，使得突變體表型恢復至野生型表型，觀察基因SsBTBI在核盤菌中的功能影響。
核盤菌的生活史
核盤菌抗逆性很強，核盤菌的菌核能夠在土壤中存活長達8年，菌核是核盤菌的病害迴圈中最主要的初侵染源，支撐著核盤菌度過各種不良的生活環境。
在良好的濕度、氣溫環境下,會重新誘導子囊盤萌發,釋放子囊孢子入侵寄主植物,同時寄主植物也會被直接由菌核階段生長出的菌絲侵染157，核盤菌可以透過在田間傳播並且侵染植株，在運輸以及儲存的過程中也會進行傳播病害。
核盤菌主要直接傷害植物的根莖，從而導致植物的根莖壞死9，從核盤菌侵染寄主植物開始，就會立即殺死寄主本身細胞並且吸收寄主植物的養分，在寄主植物上生長發育，染上菌核病的寄主植物的質素直線下降，嚴重時甚至會直接導致寄主植物的死亡10121。
核盤菌的菌絲在，0C-30°℃的溫度條件下都可以生長，在，20°℃-25℃℃的溫度範圍中，核盤菌生長最適宜，核盤菌有很強的耐酸堿能力，在酸性和堿性條件下都可以正常萌發和生長。
其中酸性環境下核盤菌可以更好地生長131，菌絲需要在潮濕的環境才可以生長,環境中需要達到85%的濕度，否則菌絲將會生長緩慢甚至不能生長，在核盤菌處於不利環境時，便有菌核的產生!核盤菌侵染植物時能夠以菌絲形態在寄主植物上短暫存活。
核盤菌的菌絲為透明狀或淺褐色狀，有隔膜以及分支，當外界環境適合時，大量的菌絲體會產生侵染墊並且快速侵染寄主植物1719，核盤菌在適宜的環境下會生長出子囊柄及子囊盤，子囊盤的萌發率和相對濕度有關系，在相對濕度在85%以上萌發率會提升，紫外線對於子囊盤有明顯的抑制作用，光照4h後子囊盤便會失去萌發子囊孢子的能力0，子囊孢子。
一般侵染點在於植株老化脫落的葉片或者是植物的傷口處侵入,從而使寄主植物染病，不易侵染健康的植株2，寄主植物感染菌核病後，感病植株透過接觸繼續感染其他健株，感病後會感染其他的健株。
核盤菌在侵染不同的寄主或者同一寄主的不同位置後的癥狀有差異，在植物葉片受到侵染時，菌絲在葉片上生長，會在葉片的表面形成侵染墊侵入表皮細胞，透過細胞間的擴充套件，侵入表皮細胞的菌絲會進一步到葉肉細胞層產生分支。
在細胞間或者穿透細胞擴充套件，直到有水漬狀的病斑，便會快速地侵染葉柄以及莖稈部位123-251，被侵染後的莖部會出現黑斑和菌絲，並且逐漸壞死的情況，在侵染初期，大多情況癥狀不明顯，而在侵染後期，菌絲侵染逐漸深入。
到達一定程度後，植物的主幹部位也會被侵染，這種情況會導致植株的萎蔫126-28，隨著侵染的加深，侵染部位進行外部泛白到逐漸分解的過程，最後只剩下維管束組織，組織表面不會有明顯菌絲的存在，莖稈內會產生菌核。
菌核及菌核形成相關因素
菌核是菌核病流行的關鍵因子，其外表堅硬，起到保護病原菌的作用!，菌核是絲狀真菌中所專有的功能，菌核病的生活史中非常重要的一部份，菌絲折看盤結的一種深色堅硬的形態，包括外殼及皮層組織和髓部。
部有著各色營養絲匯集交織，儲存著很多營養物質，菌核的生命力很頑強，抗逆性也很強，使得病原菌度過不良環境，菌核的外壁含有黑色素，從而使得菌核外表呈現黑色，有著影響菌核菌絲萌發和幫助病原菌抵禦不良環境的作用。
從菌絲到菌核的生活史有三個階段:第一階段是起始階段，菌絲產生聚集並且出現白色的菌絲團:第二階段是發育階段，菌絲生長並且進一步聚集，使得絲團體積增大:第三階段是成熟階段，菌核成型。
其外殼黑色素會產生沈積並目使得內部的結構開始鞏固[41-，在起始階段，菌絲交織形成菌核基礎，變成肉眼可見的白色顆粒狀菌核，表面會布滿白色的菌絲，且會分泌出少量的液體:在發育階段，菌絲盤結成菌核，體積逐漸變大，表面仍舊會有菌絲，顏色會慢慢地加深變成黃色乃至黃褐色。
隨著時間的推移，菌核表面的菌絲會慢慢減少;在成熟階段，液珠會出現在菌核的表面，菌核外殼的黑色素會穩步沈積，呈黑色顆粒狀,形狀為球型或者是長條型，大小基本一致，表皮凹凸不平不是很光滑，而且十分地堅硬。
菌核在形成過程中有多種因素會影響其發育，目前有許多研究表明，環境因素、細胞內的訊息傳遞途徑、蛋白磷酸酶以及凝集素類蛋白在菌核的形成過程中有著非常重要的影響。
子囊孢子塗布分離及抗性篩選
用無菌水將收集到的子囊孢子懸浮液稀釋到合適濃度，吸取100L稀釋後的孢子懸浮液，塗布於含有，100，μg/mL，HYG，和，200，μg/ml，頭孢克肟的，PDA，培養基上，等到微幹後置於，25℃℃培養。
待子囊孢子在培養基表面萌發後，挑取單菌落的菌絲尖端，轉到含有100μg'mL，HYG，的，PDA，平板上，繼代培養3，代以上，提取菌絲的，DNA，以及，RNA,設計相應引物進行，PCR，驗證，從而獲得，SsBTBI基因的敲除純合突變菌株，SsBTBI，基因在核盤菌中的表達模式。
將核盤菌野生型菌株，1980，接種於鋪有玻璃紙的PDA，上培養，1-10，d，分別收集，1-10d的菌絲、菌核以及有性生殖時期的子囊盤，提取RNA，並進行反轉錄，設計引物，SsBTB-gF，和SsBTB-qR擴增SSBTB1,以核盤菌的管家基因，Tubulin為內參基因，進行熒光定量。
PCR，熒光定量PCR反應程式:95℃℃，30s:95℃℃，10，s;60°℃,30，s;30，個迴圈，熒光定量，PCR，反應體系為2xS6，Universal，SYBR，qPCRmix，10，μL;上下遊引物，各，0.5，μL:反轉錄獲得cDNA,2μL:去離子水，7，μL，使用，2-^^CT法計算並且分析不同時期的核盤菌，&B7BI基因的表達量，每組樣品有3個重復，實驗重復3次。
菌絲生長速率的測定使用5mm，的打孔器在新鮮的敲除突變體Ssbib1-2、4Ssbrb1-3，及回補菌株4Ssbrb1-C1，與野生型菌株1980的菌絲尖端打取菌塊，分別接種於不含任何脅迫因子的定量為，17.5，mL的，PDA，培養基上，20℃℃培養36h。
每12h透過十字交叉法測量菌絲直徑，分析敲除突變體Ssbib1-2、4Ssbib1-3株及回補ASsbib1-CI菌株與核盤菌野生型，1980菌株的差異，本實驗每組有5個生物學重復，實驗重復5，次。
按照，3.2.10.1的方法培養菌株，20℃℃培養待測菌株，15，d，15d後將成熟的菌核收集轉移到無菌培養皿中，將菌核烘幹，直到菌核重量不再發生變化，隊每皿的菌核數量進行計數，稱量三皿總幹重以及百粒菌核幹重並進行分析，本實驗每組有5個生物學重復，重復實驗5次。
使用直徑為5mm，的打孔器在新鮮的核盤菌野生型菌株1980、敲除突變體4Ssbrb1-2、4Ssbrb1-3，及回補菌株4Ssbib1-C1的菌絲尖端打取菌塊，並將菌塊放置在無菌載玻片上，25℃℃培養36h，透過倒置顯微鏡觀察敲除突變體菌絲尖端及侵染墊的形態，對侵染墊進行計數。
剛果紅(Congo，Red)和，0.01%SDS，是檢測植物細胞壁和細胞膜變化的指標，與不含脅迫因子的培養基相比，抑制率越高，對細胞壁和細胞膜的影響越大:反之越小。
不同濃度梯度的高鹽(NaCl)和高滲透壓(Sorbitol)環境，觀察敲除突變體對脅迫應答的變化，抑制率越高敏感性越強，反之越弱;在植株感病後，在感病部位發生反應，產生了以過氧化氫(H0,)為主的活性，對於病原體的生長有一定的抑制作用。
結論
本實驗透過構建，&BTBI的敲除突變體與回補轉化子，結合各種生物學方法對基因，&BTBI，在核盤菌生長發育與致病過程中的功能進行研究。
獲得了&BTBI純合敲除突變體4Ssbrb1，並恢復了突變體至野生型表型敲除基因SBTB1後，在核盤菌的營養生長中，菌絲形態不變，但菌絲生長速率顯著減慢;菌核形態不變，但菌核數量及幹重重量顯著減少;菌絲尖端形態不變，但侵染墊數目顯著減少，發揮了重要作用。
敲除，SSBTB1後，敲除突變體在高鹽、高滲透壓、高活性氧的脅迫環境下耐受力顯著降低:敲除突變體仍舊具備產酸能力:對於不同濃度的殺菌劑敲除突變體敏感性顯著提升。
在離體葉片上，敲除突變體的致病力顯著降低，根據實驗結果表明，&BTBI基因在核盤菌的生長過程及致病過程中參與了調控，其編碼產物是潛在的致病因子。
