編譯：微科盟小黃，編輯：微科盟居居、江舜堯。
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導讀
鎘(Cd)汙染土壤對作物生產和人類健康構成嚴重威脅，同時也造成土地資源的浪費。本研究在Cd汙染土壤中施用兩種有機肥(ZCK：低有效鐵含量；Z2：高有效鐵含量)進行水稻種植，並結合土壤微生物分析，探討有機肥對水稻生長和Cd鈍化的影響。結果表明， Z2可以改變微生物群落的組成、結構和多樣性，增強微生物網絡的復雜性和穩定性。 施用2%和5% Z2均顯著提高了水稻植株的鮮重和幹重，同時抑制Cd的吸收。2% Z2的Cd鈍化效果最好。基因預測表明，Z2透過調節微生物產生溶解磷和鉀的有機酸來促進植物生長。此外，Z2可能透過調節微生物鎘的外排和吸收系統以及透過分泌胞外多糖，促進土壤Cd的吸收和固定。綜上所述， Z2可以促進水稻生長，抑制水稻對鎘的吸收，並透過調節土壤微生物群落來鈍化土壤Cd。
圖文摘要
論文ID
原名： Promotion of rice seedlings growth and enhancement of cadmium immobilization under cadmium stress with two types of organicfertilizer
譯名： 鎘脅迫下兩種有機肥促進水稻幼苗生長並增強鎘固定
期刊： Environmental Pollution
IF： 7.6
發表時間： 2024.2
通訊作者： 肖雲花
通訊作者單位： 湖南農業大學生物科學技術學院
DOI號： 10.1016/j.envpol.2024.123619
實驗設計
結果
1.有機肥對鎘脅迫下水稻幼苗生長的促進作用
21d後水稻幼苗的生長情況如圖1A-B所示，施用ZCK後水稻幼苗的各項生長指標均與CK無顯著差異，但施用Z2後水稻的生長狀況明顯優於CK。施用2%和5%的Z2後，水稻的鮮重(0.150~0.164 g)和幹重(0.021~0.026 g)顯著高於ZCK(圖1C~D)。在施用2%和10%的Z2後，水稻株高顯著高於ZCK (p<0.05)(圖1E)。不同施用處理下，水稻的根長在同一濃度下無顯著差異，但隨著施用濃度的增加呈負相關趨勢(圖1F)。
圖1.水稻生長指標。A.施用不同濃度ZCK後水稻的生長情況；B.施用不同濃度Z2後水稻的生長情況；C-F分別代表水稻的鮮重、幹重、株高和根長。大寫字母代表不同處理之間的差異分析，小寫字母代表不同濃度之間的差異分析。紅線代表ZCK的回歸分析，藍線代表Z2的回歸分析。
2.有機肥改變土壤理化和生化特性
種植水稻幼苗後的土壤生理生化性質如圖S1所示。除TK和pH外，土壤理化性質與施肥量(0~10%範圍內)呈顯著正相關。此外，在2%濃度下，ZCK和Z2之間沒有觀察到統計學顯著差異。然而，當濃度增加到5%時，Z2處理的OM含量(96.501 g/kg)顯著高於ZCK處理(p<0.05)。值得註意的是，當濃度達到10%時，Z2處理的OM(160.613 g/kg)、TK(36.699 g/kg)、AN(253.078 mg/kg)和AP(48.164 mg/kg)含量顯著高於ZCK處理(p<0.05)。施肥濃度對POD活性沒有顯著影響。然而，2%施肥濃度導致CAT和ACP活性降低。同樣，5%施肥濃度導致CAT和SOD活性降低。此外，與ZCK相比，2%施肥濃度使Z2中的CAT(44.319 μmol/d/g)活性顯著降低(p<0.05)，SOD(278.376 U/g)顯著升高(p<0.05)。當濃度為10%時，與ZCK相比，Z2中的ACP和SOD(6021.200 nmol/d/g和297.862 U/g)表現出顯著增加(p<0.05)。ZCK和Z2處理的TFe、Fe3+和Fe2+含量在各施肥濃度下均未表現出顯著差異。然而，與CK相比，ZCK和Z2的施用顯著增加了Fe3+含量。此外，在10%濃度下，Z2處理的Fe2+含量(0.74 g/kg)顯著高於CK(0.47 g/kg)(p<0.05)。
3.有機肥抑制水稻幼苗對鎘的吸收
水稻中總Cd含量隨施肥量的增加而顯著降低(p<0.05)(圖S2A)。ZCK和Z2在三種濃度下均能降低水稻地上部份的Cd積累(圖S2B)。與ZCK相比，Z2在2%濃度下顯著降低水稻地下部份Cd富集，而在5%和10%濃度下無顯著差異(圖S2C)。不同施肥濃度和處理之間TF無顯著差異，但Z2的TF隨著施肥濃度的增加呈下降趨勢。
施肥21 d後，土壤中Cd各形態所占比例發生變化。施肥量的增加導致殘渣態Cd含量減少，可還原態Cd含量增加。然而，在2%濃度下，與CK相比，ZCK和Z2中弱酸提取態和可還原態Cd的比例均有所下降。相反，在相同條件下，可氧化態和殘渣態Cd所占比例有所增加。值得註意的是，在所有處理中，施用2% Z2處理下弱酸提取態比例最低(4.18%)，殘渣態比例最高(85.75%)，表明其對Cd的鈍化效果最好。
4.有機肥改變土壤微生物群落的多樣性、結構和組成
Shannon指數用於評估微生物群落的多樣性。在細菌多樣性方面(圖2A)，相同施肥量下，Z2與ZCK之間無顯著差異。但隨著施肥量的增加，細菌多樣性降低。值得註意的是，與CK相比，施用2% Z2導致細菌多樣性顯著增加。在真菌多樣性方面(圖2E)，隨著施肥量的增加，ZCK處理的的多樣性呈下降趨勢。另一方面，不同施肥量下Z2的多樣性無顯著差異。值得註意的是，在2%濃度下，ZCK的多樣性顯著高於Z2。此外，與CK相比，所有濃度下Z2處理的多樣性都有所下降，而ZCK的多樣性僅在10%施肥量下降低。NMDS用於視覺化微生物群落組成的差異(圖2B和F)。不同處理之間的微生物結構存在顯著差異(p=0.001)。同時，隨著施肥濃度的增加，細菌結構呈現出一定的變化規律。
弦圖顯示了屬水平上的微生物群落組成。其中，鐵還原細菌 Anaeromyxobacter 和鐵氧化細菌 Massilia 作為優勢屬，參與了土壤中鐵離子的還原和氧化。此外，CK中前3個細菌是 Sphingomonas 、 un classified_Oxalobacteraceae 和 Gemmatimonas 。AZCK中前3個細菌是 Flavisolibacter 、 un classified_Comamonadaceae 和 Gemmatimonas 。BZCK中前3個細菌是 Flavisolibacter 、 un classified_Longimicrobiaceae 和 Lysobacter 。CZCK中前3個細菌是 Longimicrobiaceae 、 Lysobacter 和 Flavisolibacter 。AZ2中前3個細菌是 Flavisolibacter 、 Gemmatimonas 和 Sphingomonas 。BZ2中組成前3個細菌是 un classified_Longimicrobiaceae 、 Lysobacter 和 Gemmatimonas 。CZ2中前3個細菌是 un classified_Longimicrobiaceae 、 Lysobacter 和 un classified_Rhizobiaceae (圖2C)。CK和AZ2中前3個真菌是 Fusicolla 、 un classified_Fungi 和 Exophiala 。AZCK、BZCK和CZCK中前3個真菌是 Fusicolla 、 un classified_Fungi 和 un classified_Ascomycota 。BZ2中是 Fusicolla 、 Mycothermus 和 un classified_Fungi 。CZ2中是 Fusicolla 、 Mycothermus 和 un classified_Sordariomycetes (圖2G)。種水平的花瓣圖顯示了共有和特有的微生物種類。施肥後，與空白相比，細菌的特有物種數量普遍減少(圖2D)。相反，除AZCK和CZ2處理外，真菌的特有物種普遍增加(圖2H)。此外，在細菌物種中共鑒定出220個共有物種，而在真菌物種中觀察到106個共有物種。
圖2.微生物群落分析。A-D分別表示細菌Shannon指數、非度量多維標度分析(NMDS)、組成弦圖和OTU花瓣圖；E-H分別代表真菌Shannon指數、NMDS、組成弦圖和物種水平的花瓣圖。
5.透過LEfse分析鑒定差異基因
LEfse分析揭示了組間豐度存在顯著差異的微生物(圖3)。在細菌中，CK的主要差異菌屬是 Desulfosporosinus 、 Ellin6067 和 AlphaIcluster 。AZCK和BZCK的主要差異菌屬是固氮細菌，如 Azohydromonas 、 Microvirga 和 Anaeromyxobate 。 Bacillus 是CZCK的主要差異屬，能夠促進植物生長並減少Cd積累。AZ2的主要差異菌屬是 Arenimonas 、 Turiciactor 和 JGI_0001001_H03 。BZ2和CZ2的主要差異菌屬是Cd修復菌，如 Steroidoactor 、 Gemmatimonas 、 Pseudomonas 和 Lysobacter 。在真菌中，CK的主要差異菌屬是 Fusarium 、 Galactinomyces 和 Coniochaeta 。AZCK的主要差異菌屬是 Pseudoeurotium 、 Aspergillus 和 Condenascus 。BZCK的主要差異菌屬是 Talaromyces 、 Rhodotorula 和 Capronia 。CZCK的主要差異菌屬是 Coprinopsis 、 Kernia 和 Neodidymelliopsis 。AZ2主要的特異菌屬是 Myxosephala 、 Cercospora 和 Rhizoctonia 。BZ2的主要差異菌屬是 Clariredia 、 Kuraishia 和 Leohumicola 。CZ2的主要差異菌屬是 Arcopilus 、 Feromyces 和 Melanocarpus 。
圖3. LEfse差異分析。分析選擇了每種處理的前5個屬(LDA值，不包括未分類和未鑒定的屬)。A表示細菌，B表示真菌。
6.有機肥增加了微生物共現網絡的復雜性
微生物共現網絡如圖4所示，其具體參數見表1。與CK相比，施肥後土壤微生物網絡的復雜性增加。同時，網絡中細菌的比例增加，正相關和負相關趨於平衡，使網絡更加穩定。在ZCK樣本中，BZCK表現出最高的節點數(108)和邊數(1821)，形成了最復雜的網絡結構。同樣，在Z2樣本中，AZ2表現出最高的節點數(107)和邊數(1779)，顯示出最復雜的網絡配置。此外，施肥促進了模組化水平的提高，進一步增強了網絡的穩定性。圖4I所示的魯棒性分析證實，施肥網絡比CK具有更好的抗幹擾能力。在相同的施肥濃度下，Z2在2%濃度下表現得更復雜，而ZCK在5%和10%濃度下表現出更大的復雜性。
圖4.物種水平的共現網絡分析。基於物種豐度組成相關分析的Spearman相關計算方法構建的微生物網絡。參數為p值0.05，豐度閾值0.001，相關系數0.6。A-G表示不同處理的微生物網絡，H表示魯棒性分析。
表1.微生物共現網絡的拓撲參數。(原文表2)
7.微生物與土壤理化生化性質的相關性分析
相關性分析(圖5)表明，細菌多樣性與土壤全鐵(TFe)、有機質(OM)、全氮(TN)、全磷(TP)、堿解氮(AN)、速效磷(AP)和速效鉀(AK)顯著相關。然而，細菌結構與土壤生理生化特性之間沒有顯著相關性。進一步分析鎘相關細菌和土壤生理生化特性發現， Desulfosporosinus 和 Sphingomonas 與土壤理化性質(除pH外)呈顯著負相關，而 Steroidobacter 、 Pseudomonas 和 Lysobacter 與土壤理化性質(除TFe和pH外)呈正相關。此外， Bacillus 與土壤理化性質(除TFe、pH和TK外)呈顯著正相關。關於細菌與土壤生化特性的相關性，發現所有這些細菌都與過氧化氫酶(CAT)有關，其中 Desulfosporosinus 和 Sphingomonas 與CAT呈負相關，而 Steroidobacter 、 Pseudomonas 、 Lysobacte r和 Bacillus 與CAT呈正相關。
真菌多樣性與土壤Fe²⁺、有機質(OM)、全氮(TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)、堿解氮(AN)、速效磷(AP)、速效鉀(AK)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)顯著相關。真菌結構與TN、TP、AP、AK和超氧化物歧化酶(SOD)顯著相關。進一步分析鎘相關真菌與土壤生理生化特性，發現 Exophiala 和 Rhodotorula 與土壤生理生化特性有很強的相關性。其中， Exophiala 與土壤酸性磷酸酶(ACP)、POD和SOD呈顯著正相關，與土壤TN、TP、AN、AP、AK和OM呈顯著負相關。 Rhodotorula 與土壤理化性質(除TFe和pH外)呈顯著正相關，與土壤ACP顯著負相關。
圖5.相關性分析。A.細菌多樣性和結構與土壤生理生化特性的相關性。*表示存在顯著差異(p＜0.05)；B.真菌多樣性和結構與土壤生理生化特性的相關性，*表示存在顯著差異(p＜0.05)；C.鎘相關細菌與土壤生理生化特性的相關性；D.鎘相關真菌與土壤生理生化特性的相關性。
8.探索促進植物生長或鎘鈍化相關基因
本研究基於PICRUSt2預測微生物功能基因，並鑒定了一些與促進植物生長和鎘鈍化相關的關鍵基因/酶/蛋白。
在不同處理和施肥濃度下，細菌中這些基因/酶/蛋白的相對豐度如圖S3所示。施肥後，與CK相比，ZCK和Z2都顯示出固氮酶顯著減少，並且隨著施肥濃度的增加而呈顯著下降趨勢(p<0.05)。在2%濃度下，ZCK的色胺酸2-單加氧酶顯著高於Z2和CK(p<0.05)。在5%和10%濃度下，Z2的醛去氫酶(NAD(+))顯著高於ZCK和CK(p<0.05)。ZCK的異檸檬酸去氫酶(NADP(+))在2%和10%濃度下顯著高於Z2，Z2顯示出隨施肥濃度增加而顯著下降的趨勢(p<0.05)。在2%濃度下，Z2的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP)顯著高於ZCK和CK(p<0.05)。酸性磷酸酶隨著施肥濃度的增加呈顯著上升趨勢(p<0.05)，並且在5%和10%濃度下，Z2顯著高於ZCK和ZC(p<0.05)。碳酸脫水酶和D-半胱胺酸脫巰基酶顯示出隨施肥濃度增加而顯著下降的趨勢(p<0.05)，在5%濃度下ZCK的碳酸脫水酶顯著低於Z2，但在10%濃度下顯著高於Z2(p<0.05)。CzcABC調控基因編碼跨膜和細胞膜外排蛋白。CzcABC調控基因隨著施肥濃度的增加呈顯著下降趨勢(p<0.05)，在2%和5%濃度下，Z2顯著低於ZCK和CK(p<0.05)。Cad操縱子(CadC)的轉錄啟用因子是一種屬於ArsR家族的負調控轉錄因子，透過與Cd和其他金屬離子結合來感知環境中的金屬濃度。在2%濃度下，Z2的CadC顯著高於ZCK。Z2的鋅轉運蛋白在2%和5%濃度下顯著低於ZCK和CK。胞外多糖(EPS)生產蛋白隨著施肥濃度的增加呈顯著上升趨勢(p<0.05)，並且在2%、5%和10%濃度下，Z2顯著高於ZCK和CK(p<0.05)。
不同處理和施肥濃度下真菌中這些酶的相對豐度如圖S4所示。不同施肥處理之間的差異主要在2%濃度時觀察到。在該濃度下，ZCK的異檸檬酸去氫酶(NADP(+))和PEP羧激酶顯著高於Z2，而Z2的醛去氫酶、酸性磷酸酶和碳酸脫水酶顯著高於ZCK。
討論
1.兩種有機肥對土壤鎘鈍化的影響
鎘是一種重要的環境汙染物，嚴重影響作物的生長和發育。本研究探討了施用不同濃度的兩種有機肥對土壤Cd鈍化的影響。結果顯示，與CK相比，添加ZCK並未顯著改善鎘的固定。然而，對照組(CK)和ZCK相比，施用2% Z2減少了土壤中弱酸提取態Cd的含量，並增加了殘渣態Cd的比例。這可能是因為Z2能夠增加土壤中有效鐵的含量，而鐵(羥基)氧化物可以透過吸附和同構取代來螯合Cd。LEfse分析顯示，添加Z2後， Steroidobacter 、 Lysobacter 、 Kuraishia 等微生物成為主要屬。這些微生物表現出對鎘脅迫的抗性，可能透過產生胞外酶或多糖減輕鎘毒性，使鎘沈澱或被吸附。細菌中的基因預測表明，Z2顯著增加了胞外多糖(EPS)產生蛋白的相對豐度，這種蛋白可以生成能夠吸附和固定Cd(II)離子的胞外多糖。同時，czcABC調控基因的相對豐度降低減少了細菌體內Cd離子的外排。此外，酸性磷酸酶水解有機磷酸酯並釋放無機磷酸鹽，碳酸脫水酶催化二氧化碳和水生成碳酸，D-半胱胺酸脫巰基酶參與半胱胺酸生成硫化物的代謝途徑。生成的磷酸根離子、碳酸根離子和硫離子可以進一步與Cd離子反應生成難溶性沈澱。相比於ZCK，施用5% Z2顯著增加了酸性磷酸酶和碳酸脫水酶的相對豐度，而D-半胱胺酸脫巰基酶則顯著減少。這表明在該濃度下，D-半胱胺酸脫硫酶不再是參與鎘鈍化的主要酶。此外，在真菌的基因預測中，與ZCK相比，施用2% Z2顯著增加了酸性磷酸酶和碳酸脫水酶的相對豐度，而其他濃度並未表現出顯著變化。這可能歸因於它們在土壤環境中的不同生態作用，導致它們對不同濃度的Z2有不同的響應。
綜上所述，施用Z2後，水稻土中的微生物群落發生了變化。抗鎘微生物的新優勢可能主要透過分泌磷酸鹽、生成胞外多糖和調控鎘轉運相關基因來吸附和沈澱土壤中的有效鎘。同時，施用Z2形成的氧化鐵也可以吸附部份有效鎘。
2.兩種有機肥對鎘脅迫下水稻生長的影響
在鎘脅迫下，水稻容易產生大量活性氧(ROS)，導致氧化損傷。鐵是植物生長和發育的必需元素，以鐵肥的形式施用可以調節水稻的生理和代謝過程，從而增強其抗氧化能力。本研究發現，施用兩種有機肥可以促進水稻生長並抑制鎘的吸收，其中Z2的效果明顯優於ZCK(見圖1和圖S2)。Z2中的主要差異屬，如 Mycobacterium 和假單胞菌屬( Pseudomonas )，具有分泌大量生長調節因子的能力，有助於促進水稻生長。同時，施用Z2增加了土壤微生物網絡的穩定性和復雜性，有助於水稻幼苗抵抗逆境。相關性分析進一步顯示，假單胞菌屬與土壤理化性質呈正相關。有趣的是，細菌基因預測顯示，與CK相比，施肥後固氮酶的相對豐度顯著降低。這一現象可能歸因於在養分豐富的土壤中，植物已能夠自行吸收足夠的養分。因此，這也可能是由於細菌產生的吲哚乙酸減少。醛去氫酶(NAD+))和酸性磷酸酶相對豐度的增加可能是促進植物生長的主要原因。醛去氫酶(NAD+))在水稻根部起到解毒作用，並能提供有機酸來促進植物生長。酸性磷酸酶可以生成更多無機磷源，這也可能是土壤有效磷含量增加的主要原因。此外，鐵的有效性提高可促進土壤中遊離鎘的沈澱，從而減少水稻幼苗對鎘的吸收。
需要註意的是，Z2的施用量需要根據實際土壤條件和Cd汙染水平進行合理調整，以達到最佳效果。本研究發現，施用2% Z2對水稻生長最有利，而施用10% Z2則最有效地抑制了水稻幼苗對鎘的吸收。觀察到不同濃度的Z2對水稻幼苗鎘吸收的影響可能歸因於鐵的螯合特性。高濃度的鐵可以與鎘離子形成強絡合物，降低其對植物吸收的生物利用度，但過量的鐵攝取也可能導致對植物組織的毒性和損傷，特別是在負責養分和水分運輸的皮層區域，這可能阻礙植物內部鐵的運輸，從而導致生長和發育缺陷。
結論
在鎘汙染土壤中施用有機肥可以改變水稻種植中微生物群落的組成、多樣性和結構，從而增強微生物網絡的復雜性和穩定性。與CK和ZCK相比，在鎘汙染土壤中施用2%和5% Z2顯著提高了水稻幼苗的鮮重和幹重。施用2% Z2可以提高殘渣態Cd的比例，有效減輕土壤中鎘的毒性。因此，Z2可能成為農業輕度鎘汙染土壤修復和生產的強有力材料。
