文丨初八沒煩惱
編輯丨初八沒煩惱
西瓜甘甜多汁，清爽解渴，維生素C等物質含量豐富，營養價值高，具有重要的經濟價值，廣受大家喜愛。
西瓜是中國乃至全世界最重要的園藝作物之一 ，在世界範圍內廣泛種植，據估計全球西瓜的產量大約為8億噸/年，中國是世界上最大的西瓜產地與消費國，西瓜的播種面積超過3000萬畝，研究表明，食用適量的西瓜能減少慢性病的發生。
西瓜枯萎病
在中國西瓜產業蓬勃發展，產量劇增，長期連續單作使西瓜產生連作障礙，其表現方式之一就是西瓜枯萎病的大面積發生。
西瓜枯萎病通常會使西瓜減產15%～30%， 嚴重時可使西瓜減產50%～85% ，甚至絕收，尖孢鐮刀菌屬半知菌類、從梗孢目、瘤座孢科、鐮刀菌屬，是一種最重要的土傳病原菌，被評為世界第五大病原真菌。
尖孢鐮刀菌的分生孢子和菌絲體通常以腐生的方式存在於植物殘體中，厚垣孢子和菌絲可在土壤中存活5～6年。
病原菌潛伏在土壤中越冬或越夏， 透過帶病種子、田間昆蟲的移動、灌溉和堆肥傳播，尖孢鐮刀菌FON 一般透過西瓜植株的傷口、裂口或者根尖侵入，侵入後一般在根皮層細胞間繁殖，隨後侵入木質部，不斷向上侵染。
FON可分泌毒素，幹擾西瓜植株的正常代謝 ，分泌果膠酶和纖維素酶，降解植物細胞壁，導致植株枯萎死亡。
病原物鑒定最經典的方法就是透過病害癥狀辨識、癥狀鑒定和生物學特性分析等方法進行判斷，該鑒定方法不僅鑒定周期長。
同時需要相關操作人員具有豐富的專業知識 ，難以滿足病害防控需求，並且在病原真菌的檢測鑒定中，許多真菌病原體會產生相似的癥狀，難以區分不同的物種。
隨著分子生物學的蓬勃發展，基於分子檢測手段對病原物進行鑒定的方法越來越普遍，該方法可縮短鑒定周期，提高鑒定的準確性。
在之前，有研究人員利用參與細胞DNA合成、重組和修復的蛋白開發了重組酶聚合酶擴增技術，該技術主要依賴三種在37～42℃具備活性的重組酶、聚合酶和單鏈結合蛋白，目前該技術已由TwistDx商業化。
RPA的擴增產物可用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測， 可與探針結合進行即時定量檢測 ，也可與側流層析試紙條結合進行結果的即時檢測和觀察。
RPA檢測技術具有操作簡單、特異性強、靈敏度高等優點，檢測下限可達fg級別且反應只需要1對引物，在恒溫37～42℃即可產生爆發式擴增，所需溫度低；10～15min即可完成檢測，反應所需時間短。
有研究表明在缺少相關試驗器材的情況下利用人體體溫也可以進行RPA擴增反應， 其檢測結果和透過恒溫水浴鍋進行RPA擴增反應的結果一致 ，該條件下發生的RPA擴增反應仍具有較高的靈敏度。
其檢測速度快，反應時間短 ，檢測方式多樣化以及檢測結果視覺化等優點使得RPA技術在動植物病毒的檢測方面得到了廣泛套用。
但是在植物病原細菌方面的檢測僅限於由植原體引起的病害，在植物病原真菌方面的檢測更是鮮少報道。
其中 番茄細菌性葉斑病菌、柑橘潰瘍病菌、水稻細菌性谷枯病菌和白葉枯病菌等 的RPA檢測體系被相繼報道，但是沒有用於尖孢鐮刀菌西瓜專化型的RPA檢測體系。
因此本研究旨在建立FON的RPA檢測體系，以期為田間西瓜枯萎病的快速診斷和檢測提供技術支持。
供試菌株和培養條件
供試菌株：所有菌株保存於濾紙片上，置於-80℃冰箱中長期保存，將保存的真菌於PDA平板上活化，置於25℃培養箱中培養7d，將長滿平板的邊緣菌絲轉接到新的PDA平板上，置於25℃培養箱中培養7d。
目前沒有可用於RPA引物和探針設計的軟件或網站，因此按照RPA引物設計的原則：引物長度 一般在30～35nt，不要超過45nt。
引物避免出現發卡結構， GC含量最好在30%～70%，引物5’端盡量為G ，避免出現連續的C，3’端最好以G或C結尾。
引物擴增子的長度最好在150-300bp，不宜超過500bp，按照該原則在1.3中篩選得到的4個特異性基因片段的上下遊各設計3條引物，根據正交組合每個片段可得到9對不同的引物組合。
按照RPA探針的設計原則：在上下遊引物中間，找一段長為46-52nt的片段，在該片段互補序列的5’端用常用抗原FAM修飾。
在其3’端用C3-Spacer修飾， 5’端和3’端中間用四氫呋喃THF標記 ，作為探針的辨識位點。
將提取得到的西瓜枯萎病菌基因組DNA進行梯度稀釋，用篩選得到的特異性引物進行靈敏度的驗證，所用FON基因組DNA濃度梯度依次為： 100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL ，每組試驗重復3次。
RPA反應體系的建立
因得到的引物數量過多，考慮到反應成本問題， 所以首先用普通PCR反應對設計的引物進行初步篩選 ，PCR反應結束後再用瓊脂糖凝膠電泳對試驗結果進行檢測。
其中C圖所用引物只能從西瓜枯萎病菌基因組、香蕉枯萎病菌基因組和菊花枯萎病菌基因組中擴增出條帶，且從香蕉枯萎病菌基因組中擴增出的條帶相對擴增出的其他條帶而言亮度較弱。
因此選擇681-31-F/681-31-R作為初步篩選到的特異性引物。
結合DNA恒溫快速擴增試劑盒進行RPA擴增，擴增產物取10μL稀釋20倍之後進行膠體金試紙條檢測， 剩余15μL擴增產物用試劑盒回收之後，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測 。
用兩種檢測方法來驗證該引物 在進行RPA擴增反應時的特異性，側流層析試紙條結果 ，表明，以FON基因組DNA為樣版的擴增產物在膠體金試紙條的質控線和檢測線處均出現清晰的條帶。
而以其他10種供試病原真菌基因組DNA為樣版的擴增產物在膠體金試紙條上只顯示一條質控線，表明681-31-F/681-31-R引物對FON的特異性較強。
瓊脂糖凝膠電泳結果表明，以FON基因組DNA為樣版的RPA擴增產物回收之後用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，能夠看到清晰的條帶大小約為189bp的條帶。
其他10種供試病原真菌基因組DNA為樣版的擴增產物回收之後無擴增條帶的產生， 再次說明該引物對FON有良好的特異性。
為驗證本研究中篩選的引物對全國其他地域FON分離株的效果，試驗選取7個不同地域的FON分離株進行特異性檢測，結果表明，引物681-31-F/681-31-R能夠檢測到來自全國7個不同地域的FON分離株。
將西瓜枯萎病菌基因組DNA進行梯度稀釋， 使其濃度分別為100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL ，利用DNA恒溫快速擴增試劑盒進行擴增，擴增產物分別進行側流層析試紙條檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測。
其中瓊脂糖凝膠電泳試驗結果表明建立的RPA檢測體系的檢測下限為100pg/μL，側流層析試紙條檢測結果表明建立的RPA檢測體系的檢測下限為1ng/μL，兩者結果不完全一致。
分析原因可能是由於進行側流層析試紙條檢測時， 對擴增產物稀釋20倍之後才進行上樣，導致靈敏度出現些許降低。
為驗證本研究中所建立的RPA檢測體系在實際套用中的可行性和其在田間進行實際檢測的效果，本次試驗直接采用膠體金試紙條進行擴增結果的檢測。
接種西瓜枯萎病菌後在植株顯癥之前隨機選取4株西瓜植株 ，提取其基因組DNA，以未接種FON的西瓜植物組織基因組DNA為空白對照，利用DNA恒溫快速擴增試劑盒進行RPA檢測。
RPA擴增結束後將擴增產物稀釋20倍， 取50μL稀釋產物直接用膠體金試紙條進行反應結果的檢測。
結果表明，以接種FON未顯癥的4株西瓜植物組織基因組DNA為樣版的RPA擴增產物經試紙條檢測後均出現2條條帶，而以未接種FON的西瓜植物組織基因組DNA為樣版的RPA擴增產物經試紙條檢測後只出現一條質控線。
西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型FON侵染西瓜引起的病害 ，該病害發病面積廣，發病速度快，對西瓜的產量影響極大。
目前沒有可以徹底清除發病地塊中西瓜枯萎病菌的方法，導致西瓜種植過程中的連作障礙逐年加重。
中國作為西瓜生產和消費的第一大國，西瓜種植過程中一旦發生西瓜枯萎病將導致極大的經濟損失。
透過苗期管理、輪作和嫁接的方法防控西瓜枯萎病難度和成本高 ，難以進行大面積推廣；培育抗病品種周期長且FON分化類別多，難以進行多位點抗性育種。
化學防治是指利用化學農藥對植物病害進行防治的方法，該方法見效快，防效高，但存在對人畜不安全，環境汙染大等問題。
生物防治是當下防治西瓜枯萎病的最佳選擇之一 ，但生物防治見效慢，適用範圍小且使用效果易受天氣影響。
因此，建立西瓜枯萎病菌的快速檢測技術對西瓜枯萎病的流行預測以及制定有針對性的防控策略具有重要的意義。
此項研究透過生物資訊學分析篩選得到了FON的4個特異性片段並對其進行RPA引物的設計， 之後透過普通PCR擴增反應對引物進行特異性和靈敏度的篩選。
並用DNA恒溫快速擴增試劑盒對其進行驗證，得到對FON特異性和靈敏度較好的一對引物，利用該引物的擴增片段設計RPA探針。
對擴增效果較好的反向引物進行修飾， 再用DNA恒溫快速擴增試劑盒進行擴增反應 ，擴增結束後取10μL擴增產物稀釋20倍進行膠體金試紙條檢測。
剩余15μL擴增產物用試劑盒回收，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以篩選確定合適的探針，最後利用篩選得到的特異性引物和探針進行溫室接種西瓜植株的RPA檢測。
結果表明本研究中所建立的RPA檢測體系能夠從溫室接種未顯癥的西瓜植株中檢測到FON， 可為田間西瓜枯萎病早期的快速檢測提供技術支持。
RPA未來的發展會更多的集中於現場檢測和多重檢測 ，多重檢測有望透過一個RPA反應實作對多種病原物的檢測。
