2月1日，清華大學生命學院劉俊傑課題組在【科學】 （Science） 雜誌線上發表了題為【可編程的水解型核酸內切核酶用於DNA靶向切割】（Hydrolytic endonucleolytic ribozyme（HYER）is programmable for sequence-specific DNA cleavage）的研究論文，報道了一種催化性RNA（核酶）—HYER（水解型內切核酶）。HYER可序列特異地切割RNA和DNA受質，並對哺乳動物細胞基因組產生位點特異的編輯。無需蛋白核酸酶的參與，HYER的受質辨識和切割均由RNA分子實作，有望成為繼CRISPR之後新一代的基因編輯底盤工具。
圖1.歷代基因編輯工具
基因承載著遺傳資訊，定義了生命的多樣性和復雜性。基因編輯是理解和改造生命的關鍵技術，在生物學研究和生物產業發展中發揮著重要作用。歷代基因編輯工具如巨核酸酶、ZFNs、TALENs，均以蛋白質為基礎辨識和切割DNA，編輯位點的重編程較為困難。目前被廣泛使用的CRISPR-Cas工具，是RNA引導的蛋白核酸酶，透過引導RNA的間隔序列來辨識DNA，具有很好的編輯位點重編程能力，但依然存在著PAM序列限制、分子量大、蛋白免疫原性等多種問題。
HYER源自細菌逆轉座子（第二類內含子，GIIintron），一種可在宿主基因組上「拷貝和貼上」（逆轉座）的可移動元件。該元件通常編碼一個兼具核酸酶和逆轉錄酶活性的蛋白質以及一個RNA分子，透過形成蛋白核酸復合物(RNP)來執行在宿主基因組中的逆轉座擴增。有趣的是，透過廣泛的生物資訊學篩選，劉俊傑課題組發現了許多不編碼蛋白的、緊湊的二類C型內含子（ORF-lessGII-Cintron）在細菌基因組中存在多拷貝的現象。這一現象暗示，這些內含子編碼的唯一組份RNA分子，可能具有不依賴蛋白的擴增位點辨識和切割能力，來實作內含子在宿主基因組內的拷貝擴增。
圖2.不含蛋白組分的第二類內含子RNA在基因組中「拷貝和貼上」的假設示意圖
生化實驗表明，這些長度約600nt的RNA分子在廣譜的離子濃度和溫度範圍內，具有顯著的RNA和DNA水解切割活性。因此，研究人員將這些RNA分子命名為水解型內切核酶（Hydrolytic Endonucleolytic Ribozymes, HYERs），這是科學界首次報道具有DNA水解切割能力的核酶（Ribozyme）。值得註意的是，HYER1和HYER2表現出了與緊湊型的CRISPR-Cas12e（CasX）和Cas12l（Casπ）相當的DNA體外切割效率。
為檢驗HYER在細胞內的DNA切割能力，研究人員在大腸桿菌中構建了ccdB毒蛋白報告系統，證明HYER1和HYER2可以對帶有ccdB毒基因的質體進行靶向切割。在HEK293T細胞內，研究人員構建了移碼Puromycin抗性基因（puro*）報告系統。結果表明，HYER1可對puro*產生移碼編輯，賦予細胞Puromycin抗性。在抗性篩選富集後的細胞裏，三個靶位點中最高的編輯效率為9.18%。這表明，HYER可以在真核細胞基因組中引入雙鏈斷裂並產生編輯。然而，在未經Puromycin篩選富集的細胞中，編輯效率僅為0.09%到0.2%，表明HYER的真核基因編輯能力還有很大的進步和最佳化空間。
研究人員利用冷凍電鏡獲得了HYER1的高分辨三維結構（3.0Å），發現HYER1以同源二聚體的形式存在，並揭示HYER1水解切割DNA的機理。HYER1透過一段暴露的單鏈RNA（6nt）區域，TRS（Target Recognition Site），辨識並招募DNA受質，將DNA捕獲在結構域V所形成的催化核心中，透過經典的雙鎂離子機制催化DNA水解。
圖3.HYER1的電子密度圖和DNA水解切割機制
基於HYER的三維結構，研究人員進行了多種理性設計，證明HYER具有良好的可編程性，可根據受質序列靈活設計TRS的序列和長度；在TRS臨近區域插入14nt的受質招募序列（Recruiting Sequence,RS），可明顯提高HYER1的受質辨識特異性和切割效率；對回文序列和TRS進行改造， HYER1則可形成帶有兩個不同TRS的異源二聚體，靶向雙鏈DNA受質的不同區域，產生了具有5’突出、3’突出或平末端的客製化切割產物。
受「RNA世界」假說的啟發，研究人員提出了第二類內含子中的「RNA的催化功能逐漸被蛋白質取代」的分子前進演化歷程：在前進演化過程中，第二類內含子的結構域IV逐漸擴大，並產生了可編碼短肽的開放閱讀框（ORF），而這些短肽可作為順式元件與內含子RNA相互作用，增強其結構穩定性和催化活性；隨著ORF變得更長、更為成熟，其編碼的蛋白質不僅起到穩定結構的作用，亦獲得了DNA切割和逆轉錄活性，以替代RNA核酶行使催化功能。該成果不僅拓展了科學界對「RNA世界」假說和RNA催化功能的理解，也為創制具有中國完全自主知識產權的新型核酸操縱底盤工具，以及將其進一步用於基因編輯和RNA編輯等奠定了基礎。
圖4.第二類內含子的前進演化假想
清華大學生命學院劉俊傑副教授為本文通訊作者；清華大學生命學院2021級博士生劉子賢、高精尖結構中心卓越學者張壽悅博士、2020級博士生朱漢舟、博士後陳之航、2019級博士生楊韻和2022級博士生李隆騏為該文共同第一作者；清華大學生命學院2021級本科生劉雲、2018級博士生李丹苑、2020級博士生孫奧、李承平、2021級博士生譚順青、2023級博士生王高立、2023級博士生沈婕怡、水木學者靳帥博士，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究員和2020級博士生雷源為本研究作出了大力貢獻。清華大學冷凍電鏡平台為本研究提供了器材和技術支持。本研究得到了基金委原創專案（32150018）、農業部和清華大學的經費、資源支持。
論文連結：
Hydrolytic endonucleolytic ribozyme (HYER) is programmable for sequence-specific DNA cleavage | Science
供稿 | 生命學院
編輯 | 黃思南
稽核 | 王曉霞
