陸鈺明/朱健康組合作實作大幅增強基因表現的通用解決方案

基因表現的精準調控對於物種改良至關重要，通常依賴於轉基因技術。隨著CRISPR/Cas介導的敲入技術的發展，精確地在植物基因組中插入序列成為可能。如果能夠實作有針對性地將強化子插入基因的啟動子區域，實作直接增強轉錄的「原位啟用」，則有望克服對轉基因的依賴和隨機性編輯的局限。但適合精確敲入的短轉錄強化子（STEs）的短缺限制了其在植物育種中的套用。符合監管政策的短序列、高效的內源性STEs的需求迫切，但目前相關研究非常有限.

圖1. STEM技術，實作STE的全基因組挖掘

區別於Starr-seq技術，該研究首先開發了一種名為STEM的一種高通量篩選強化子的方法。為了大規模地從物種基因組中篩選出具有不同調控能力的強化子，該研究提供了一種含條形碼載體系統，將每個條形碼與候選強化子元件一一對應，透過測量條形碼的豐度，獲得候選強化子元件的啟用倍數。基於STEM，透過分析水稻基因組中關鍵候選基因的啟動子區域，研究團隊鑒定了11610個候選STEs，並利用條形碼介導的RNA-seq分析，成功鑒定了122個來自病毒及水稻的短強化子，其中來自病毒的強化子最高能夠達到1000倍的啟用效果，來自水稻內源的強化子最高能夠達到66.6倍的啟用效果，其中最短的強化子長度為40bp，大多數集中在100bp。該研究透過體外實驗確定了STE插入的最佳位置，發現越接近轉錄起始位點（TSS），增強效果越強。在水稻多個不同基因中進行的目標敲入實驗中，實作了高達176倍和869.1倍的基因表現上調，且該上調效果在多代中穩定遺傳。

圖2.高達1000倍的原位啟用

此外，為了驗證梯度啟用的可行性，該研究選擇了四個具有不同啟用能力的STEs，包括來自病毒的STEvs011和STEvs007，以及水稻衍生的STEos026和STEos045。透過將這些STEs的供體DNA片段混合並轉化水稻愈傷組織，研究人員成功獲得了不同STEs插入的水稻T0代植株，並觀察到 EUI 和 RFT1 基因表現的梯度上調。與此同時，研究人員還探討了同時啟用多個基因的可能性。以菸鹼醯胺單核苷酸（NMN）生物合成途徑為例，研究人員設計了六個相關基因的sgRNA位點，並構建了相應的CRISPR/Cas9質體。透過單次轉化，研究人員成功實作了多達四個基因的同時啟用，並顯著增強了NMN代謝途徑。

該研究透過開發一種創新的全基因組篩選方法STEM，實作了短轉錄強化子（STEs）的高效篩選，並在水稻中成功套用了「原位啟用」技術。此外，該研究證實了透過「原位啟用」技術實作的基因上調效果在多代植物中具有穩定的遺傳性，解決了傳統轉基因技術中常見的代際不穩定性問題，透過使用不同STEs實作了目標基因表現的梯度調控，透過單次轉化實作多個基因的同時啟用，這為復雜性狀的精細調控和改良提供了新的可能性。該工作強調了對高效、短序列、具有特定活性的內源性STEs的進一步研究的必要性。未來透過探索STEs的時空特異性表達調控機制，將為植物遺傳改良提供更為精確的工具。鑒於基因組編輯技術相較於傳統轉基因技術在監管政策上的優勢，該研究為符合政策導向的作物改良提供了新的思路。

圖3. 可設計、可遺傳、多基因的原位啟用

姚琦博士、沈潤東博士和邵揚博士為共同第一作者，陸鈺明教授和朱健康院士為本文通訊作者，田益夫博士、韓沛津博士、張學寧博士也參與了該研究。該研究得到了科技部重點研發計劃青年專案、上海市農業套用技術開發專案和國家自然科學基金專案資助。

值得註意的是，陸鈺明課題組也在今年5月份在 New Phytologist 發表了題為「In-locus gene silencing in plants using genome editing」的研究論文，成功開發了「原位沈默」技術。透過在5’UTR區敲入一種多功能調控元件ATGE，該方法可透過一次敲入實驗，獲得具有不同敲低程度的基因編輯材料，從而建立了一種高效率、可遺傳、非轉基因的新型基因沈默技術。結合該團隊獨特的敲入技術(Nature Biotechnology 38:1402)，其已成功建立了完全自主的基因編輯育種體系，實作了低至10%、高達1000倍，可通用、可設計、可遺傳的基因原位調控。

（來源：MP ）