前言：間充質幹細胞（MSC）來源的細胞外囊泡（EV）是調節周圍組織微環境的重要訊號分子，內含多種訊號物質，如訊號蛋白、miRNA、RNA和DNA等。近年來，EV在抗衰和臨床治療中表現出顯著效果，而且可以避免幹細胞治療可能引發的炎癥反應、血管堵塞和疾病傳播的風險，備受業界青睞。但如何獲取高質素的EV是臨床套用和產業化生產中亟需突破的瓶頸問題，值得深入探究。
傳統獲取MSCs-EVs的主要方法是血清饑餓培養（SC），但SC可能存在減緩細胞增殖、誘導細胞雕亡和囊泡質素不高等局限，減弱EVs的治療效果。因此， 科研人員提出了一種連續營養供應培養（CC）的新策略來獲取EVs，透過使用化學成分確定的培養基持續給MSCs提供各種營養物質和生長因子，改善EVs的生長條件。 透過與SC策略比較，發現CC策略可以有效地抑制MSCs的自噬和雕亡，提高EVs產量；透過小鼠UVB光老化實驗，證明CC-EVs可促進細胞增殖，抑制慢性炎癥反應，抗衰老作用更佳。
1.CC策略帶來高產量、高質素的EVs
本研究CC策略采用Regenα-Geek的UltraMedia®無血清培養基，SC策略則選擇Gibco的DMEM/F12培養基。臍帶來源的組織長出原代MSCs後，置於含有5％CO2的培養箱中於37℃中傳代培養，並於細胞融合至80%時獲取細胞上清液，采用超速離心法收集EVs（圖1a）。透過電鏡發現，顆粒呈圓形具有雙層膜結構（圖1b），尺寸多數為30-150 nm（圖1c），另外，蛋白質墨點法確認這些顆粒存在典型外泌體標記物（圖1d），最終確認收集到的顆粒為MSCs來源的EV。在同體積細胞上清液和分離方法下，CC-EVs的蛋白質含量明顯較高（圖1e）。另外，每個CC-MSC衍生的EVs數量約為2.4 × 105個顆粒，約為SC-MSC的1.4倍（圖1f）。 CC-EVs的濃度約為1.4×1012個粒子/mL，產量顯著提高，特別在30–150nm尺寸範圍內，其數量差異最明顯（圖1g/h）。
圖1：CC-EVs和SC-EVs的表征及產量情況
探究CC策略促進EVs形成的機制，首先檢測MSCs的狀態差異。CC-MSCs自噬標誌物LC3 II（圖2a/b）和雕亡重要標誌物PARP（圖2a/c）表達較SC策略均降低；流式細胞術結果顯示，CC-MSCs總細胞雕亡率與SC-MSCs相比下降了2.85%（圖2d）。其次，對參與EVs形成與釋放的蛋白質進行了分析，發現CC策略可上調內吞體分選轉運復合體（ESCRT）的重要蛋白表達，如HRS和TSG101，並加速MSCs的膜轉運和EVs的形成，此外，CC-MSCs還表達更高水平的Rab27a和Rab27b蛋白（圖2e/f/g）， 表明CC策略刺激Rab27蛋白的合成，以加速EVs前體向質膜（PM）轉運。
圖2：CC-MSCs和SC-MSCs的狀態差異
最後，對細胞膜融合過程進行探討。CC-MSCs膜表面的四跨膜蛋白（CD81、CD9和CD63）強陽性細胞百分比更低（圖3a/b），胞內四跨膜蛋白的含量更高（圖3c/d），證明CC-MSCs有更多含有四跨膜蛋白的PM被內吞形成EVs前體。透過電鏡捕獲的影像可看出， CC-MSCs內的多囊泡體（MVE）數量多且形態更加成熟 （圖3e/f）。
圖3：CC-MSCs和SC-MSCs的膜融合分析
由此可見，CC策略可以抑制MSCs的自噬和雕亡狀態，上調EVs相關膜轉運蛋白的表達，加速MSCs內小分子訊號物質的轉運和對外釋放，促進MSCs釋放更多的EVs。
2.CC策略來源的EVs具有更強的抗衰老能力
UVB光損傷的皮膚修復主要涉及人上皮成纖維細胞（HEF）的再生和遷移。將HEFs與紅色熒光示蹤劑PKp6標記的EVs孵育24小時後，檢測到HEFs核周圍含有紅色熒光顆粒（圖4a）。CCK-8法顯示CC-EVs改善光損傷的細胞增殖的效果更好（圖4b），並采用BrdU ELISA試驗再次驗證，CC-EVs促進衰老的HEFs進入S期合成DNA，表現出更強的增殖能力（圖4c）。劃痕愈合測試顯示，用CC-EVs處理老化細胞，其傷口愈合速度更快（圖4d/e）。
圖4：EVs對HEFs的再生和遷移影響
β-半乳糖苷酶（β-gal）染色顯示，UVB照射誘導HEFs衰老（圖5a）。EVs與衰老HEFs 共培養48小時後，細胞中的β-gal活性顯著降低（圖5b），導致膠原蛋白和彈性蛋白分解的基質金屬蛋白酶（MMP1）表達下調（圖5c），I型膠原合成增加（圖5d），並且衰老細胞中p53的表達水平降低（圖5e/f），受損的DNA得到修復。 這說明EVs具備抗衰能力且CC-EVs表現更佳。
圖5：EVs改善HEFs的衰老狀態
動物實驗中，光損傷的KM小鼠上皮明顯增厚粗糙，真皮纖維分布紊亂，皮膚附屬器減少，經CC-EVs和SC- EVs治療後皮膚均變得明顯光滑，曬傷瘢痕得到有效修復（圖6a/b）。Masson染色顯示，CC-EVs治療組的小鼠上皮厚度顯著減少，膠原纖維再生，皮膚附屬器再生並均勻排列（圖6c/d）。為研究EVs在皮膚老化和膠原再生方面的分子機制，對皮膚蛋白質樣品進行了分析，結果發現，CC-EVs顯著抑制組織中MMP1合成，下調腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的表達，啟用NF-κB訊息傳遞通路，減輕慢性炎癥反應。此外，CC-EVs顯著上調轉化生長因子（TGF-β）的表達，促進皮膚組織中I型膠原蛋白（COL I）再生（圖6e/f）。
圖6：CC-EVs和SC- EVs在KM小鼠實驗中的表現
miRNA在許多生理和病理狀態的調控中發揮關鍵作用。對CC-EVs與SC- EVs的miRNA進行多方位分析比較：主成分分析（PCA）因子顯示，PC1和PC2清楚地分離兩組EVs的miRNA表達譜（圖7a）；Venn圖顯示CC-EVs有663個miRNA，SC- EVs有552個miRNA（圖7b）；透過熱圖揭示兩組EVs的miRNA差異情況，共有125個miRNA表達顯著差異，55個miRNA在差異倍數分析顯示CC-EVs中有46個上調（83.6%），9個下調（17.4%）（圖7c/e）。 由此可見，CC-EVs與SC- EVs存在差異表達的miRNA。
圖7：CC-EVs與SC- EVs的miRNA分析
另外，miRNA相互作用網絡圖（圖7d）中顯示，CC-EVs中有多個miRNA靶向NF-κB訊號通路下調衰老相關因子MMP1和β-gal；同時，miR-493等作用於靶基因TNF-α38，抑制NF-κB訊號通路，下調核內炎癥因子的轉錄，降低機體氧化應激水平。 結果表明，CC策略可以改變細胞囊泡攜帶的訊號物質，使EVs含有更多的抗衰老因子，並抑制NF-κB訊號通路啟用引起的慢性炎癥（圖7f）。
相關研究內容以 Continuous nutrient supply culture strategy controls multivesicular endosomes pathway and anti-photo-aging miRNA cargo loading of extracellular vesicles 為題發表在雜誌 Journal of Tissue Engineering (JTE) 。研究者希望透過最佳化EVs培養策略來縮短獲取MSCs上清液的時間和降低成本，為大規模生產EVs提供方向，推進EVs在動物實驗以及臨床治療中的套用。
