引言
Hippo訊號通路 （Hippo signaling pathway） 是一條高度保守的，在組織生長調控、組織穩態 （tissue homeostasis） 維持以及再生修復等過程中均扮演重要角色的訊號通路，其功能失調會導致包括癌癥在內的多種疾病。Hippo訊號通路包含一個由激酶級聯和轉錄因子復合物組成的核心通路，以及眾多的上遊調節因子。Hippo通路上遊沒有特異的受體和配體，但是它卻能夠感受非常多樣的訊號，如機械力、細胞極性、滲透壓應激和細胞-細胞接觸等。盡管這種上遊訊號的多樣性被認為是生物體能夠精細調節組織生長和結構的基礎，但Hippo訊號通路的上遊調節因子如何整合多種訊號的機制仍有待進一步闡明。
2024年8月9日，美國德克薩斯大學西南醫學中心的 潘多加 院士團隊在 Science 線上發表了題為 PI4P-mediated solid-like Merlin condensates orchestrate Hippo pathway regulation 的研究論文。該研究綜合利用遺傳學、細胞生物學和生物化學的方法， 闡述了Hippo訊號通路上遊調節因子Merlin透過形成固態樣凝聚體調控Hippo訊號通路的新機制，並揭示了Merlin固態樣凝聚體受到上遊訊號的雙向調控。
潘多加教授團隊2022發表的研究表明，Hippo通路的上遊抑制因子SLMAP與上遊啟用因子AMOT和KIBRA透過液-液相分離 （LLPS） 形成功能拮抗的生物分子凝聚體。這些功能相互拮抗的液態凝聚體可以進一步聚合成一個共同的凝聚體，從而調控Hippo通路 。而本項發表於 Science 的工作則是研究了另一個重要的Hippo訊號通路的上遊調節因子Merlin。Merlin是一個經典的腫瘤抑制因子，其突變會導致神經纖維瘤病II型疾病 （NF2） 以及其它類別的腫瘤的發生。
為了研究Merlin在體內的功能和調控機制，作者建立了表達Merlin-mNeonGreen （Mer-mNG） 熒光蛋白的果蠅系。Merlin是一個已知的細胞膜定位蛋白，熒光成像和光漂白實驗結果顯示，Merlin在極化的果蠅上皮細胞頂端細胞皮層 （apical cell cortex） 存在兩個不同的定位：一部份動態Merlin蛋白位於細胞-細胞連線 （cell junction） 處，另一部份Merlin在頂端細胞皮層中部 （medial apical cortex） 形成非動態的顆粒 （圖1） 。果蠅細胞內形成的Merlin顆粒高度穩定，用 細胞裂解液 稀釋或1,6-Hexanediol化合物處理都不能溶解Merlin顆粒，同時體外純化的Merlin蛋白也能形成非動態的穩定顆粒。這些實驗結果表明，Merlin能夠形成具有固態物理特性的生物分子凝聚體。
圖1. Merlin及其突變體形成具有不同物理特性的凝聚體（Credit: Science ）
透過對Merlin蛋白結構域分析發現，Merlin凝聚體的形成由卷曲螺旋結構域 （coiled-coil domain，CC） 介導，CC結構域突變 （mutCC） 後Merlin不能形成凝聚體，並且無法定位到細胞膜上。為了研究Merlin凝聚體固態樣物理性質的重要性，作者在Merlin mutCC突變體蛋白裏分別引入DIX或FUS結構域從而構建兩個新的融合蛋白。這兩個能夠多聚化的蛋白結構域的引入使Merlin mutCC突變體恢復了凝聚能力。熒光成像和光漂白實驗顯示DIX融合蛋白形成非動態、穩定的固態樣凝聚體，並且只定位於頂端細胞皮層中部。與之不同，FUS融合蛋白主要定位於細胞連線處，同時形成少量高度動態，位於頂端細胞皮層中部的液態樣凝聚體。已知在果蠅卵室 （egg chamber） 後部的follicle 細胞裏，Hippo通路的阻斷 （包括Merlin失活） 會導致 cut 基因的異常高表達。利用這一表型，作者檢驗了融合蛋白的活性，發現野生型Merlin蛋白和DIX融合蛋白都能恢復 merlin 突變細胞 cut 基因的正常表達，但是mutCC突變體和FUS融合蛋白則不能恢復。 這一結果表明Merlin只有在形成固態樣凝聚體時才能在體內正常介導Hippo訊號傳導 （圖2） 。
圖2. Merlin凝聚體的固態物理特性對其活性至關重要（Credit: Science ）
進一步研究發現， Merlin透過與細胞膜上的磷脂酰肌醇-4-磷酸 （PI4P） 直接結合定位到細胞膜上，而膜上PI4P的濃度可以調控Merlin的定位；反之Merlin的凝聚也可以影響其與PI4P的結合。透過正向遺傳篩選，作者發現另一個Hippo通路上遊調節因子Pez可以透過增加頂端細胞膜中部的PI4P濃度來促進Merlin的凝聚。這些結果揭示了一種Merlin固態樣凝聚體的正向調控機制。
與Pez不同，細胞骨架張力 （cytoskeletal tension） 一方面可以透過減少頂端細胞膜中部的PI4P從而抑制Merlin凝聚體的形成，另一方面也能直接作用於Merlin凝聚體促進它的解聚。透過改變細胞外液體滲透壓從而改變細胞骨架張力，作者發現低細胞張力促進Merlin固態樣凝聚體的形成，而高細胞張力則促進Merlin凝聚體從固態到液態的物理狀態轉變，並導致Merlin凝聚體的解聚。有意思的是，被釘選在固態樣的DIX融合蛋白凝聚體可以抵抗高細胞張力引起的解聚。另外，以前的研究發現在果蠅卵室裏，缺氧可以引起細胞膜上PI4P濃度的顯著下降。利用這一系統，作者發現 Merlin凝聚體的固態樣物理特性使得它可以抵抗缺氧導致的Merlin蛋白從細胞膜的脫落。
圖3. 固態樣Merlin凝聚體在極化上皮中的功能和調控（Credit: Science ）
綜上所述，本項研究 首次揭示了腫瘤抑制因子Merlin在體內形成固態樣凝聚體，並行現這些凝聚體的固態樣材料特性不僅對於其生理功能至關重要，還能保護它們免受如缺氧和低滲透壓等外部擾動的影響。該研究提示固態樣生物分子凝聚體的固態樣物理性質可能是一種維持訊號穩定性的普遍機制，同時固態樣凝聚體的形成和解聚可以受到雙向調控以滿足不同的生理功能需求 （圖3） 。
參考文獻
http://doi.org/10.1126/science.adf4478
責編 |探索君
排版|探索君
文章來源|「BioArt」
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