SARS-CoV-2於2019年出現，導至冠狀病毒病（COVID-19）的淪陷性大流行，嚴重損害了人類健康和全球經濟。SARS-CoV-2由於其不斷的突變導至免疫逃逸而繼續前進演化，持續前進演化的SARS-CoV-2變體帶來增加病毒傳播的風險和疫苗失敗。面對這一威脅，必須開發一種可延伸的檢測SARS-CoV-2的工具，以提供有關突變的資訊。
病毒變異的診斷對目前的方法提出了挑戰，因為它要求辨識單核苷酸變異（SNVs）的高特異性，以及在不犧牲簡單、快速或成本的情況下區分不同變異的多路復用能力，特別是在即時檢測套用中。
近日，雜誌Nature protocols 上發表了一篇文章， 作者提出了一種簡單的MARVE方案（multiplexed, preamplification-free, single-nucleotide-resolved viral evolution），這是一種無需預擴增、比色核酸檢測，允許在單核苷酸分辨率下快速和低成本檢測病毒變異。
圖片來源：Nature protocols
MARVE檢測流程概述
MARVE的關鍵創新是設計了一種金屬離子的雙鏈DNA探針（稱為TE探針），它將核酸辨識與酶擴增結合起來。TE探針是一個Ag (I)離子結合的雙鏈DNA，包含一個Rec鏈和一個順式鏈（block鏈），雙鏈退火雜交形成一個C-Ag (I)-C人工堿基（如下圖）。具體來說，reverse toehold上的C-Ag (I)-C人工堿基設計為胞嘧啶-胞嘧啶（C：C）錯配，可以透過堿基金屬陽離子相互作用與金屬離子Ag (I)結合。透過鏈置換過程，病毒RNA與TE探針的結合破壞了C-Ag (I)-C人工堿基對並釋放Ag (I)。Ag (I)對脲酶有很強的抑制作用，脲酶催化尿素裂解產生Np+ 改變了溶液pH；然後用pH指示劑酚紅比色表示病毒RNA的存在。將DNA探針、脲酶和顏色指示劑混合物設計在可折疊的測試紙上，病毒RNA可以透過紙折疊過程檢測到，結果可以透過肉眼或基於智能電話的檢測器材讀取。
MARVE檢測方法檢測過程的示意圖。
圖片來源：Nature protocols
MARVE檢測方法的特點
新的檢測方法最好具有以下特點：(1)高特異性來區分病毒RNA中的SNV，能夠辨識病毒變異；(2)具有多路復用能力，涵蓋檢測多個關註或感興趣的變異；(3)與測向流動測試相媲美的便利性和成本效益。
MARVE檢測方法描述的無需預擴增比色核酸檢測方法滿足以下要求：(1)TE探針可以透過核酸鏈置換反應的編程區分單個核苷酸不同的序列；(2)可折疊紙張作為芯片，可根據需要設計多個檢測點進行多路復用；(3)該方法消除了核酸擴增反應，可以像測向流動試驗一樣讀出。總的來說，MARVE檢測結合了核酸檢測的特異性和橫向流動檢測的便利性，並為分析不同的病原體提供了一種可編程的多路復用性。
MARVE檢測方法的概述。 圖片來源：Nature protocols
MARVE檢測方法的套用
作者演示了在人工咽拭子樣本中篩選SARS-CoV-2變異，包括Alpha、Beta、Gamma和Delta。在對50份臨床咽拭子樣本的檢測中使用該檢測方法，與RT-qPCR和測序結果100%一致。透過該檢測方法檢測到的病原體還能被擴充套件到植物病原真菌、細菌和病毒。套用該方法檢測SNV，作者還研究了細菌的抗生素耐藥性、真菌的抗真菌素耐藥性和腫瘤的耐藥性。
此方法具有成本效益，可多路復用，具有單核苷酸精確度，可作為測序的補充工具。此外，透過在溶液中進行檢測，該檢測方法包括使用酶標儀進行高度多路復用和快速的樣品應答測試，使其成為透過快速和高通量病原體定量篩選抗病原體藥物和治療試劑的有效工具。
總的來說，MARVE檢測方法簡單方便，可在資源有限的情況下的適用性，如家庭、學校和機場。此外，這種智能電話可讀的檢測方法很便宜（每次檢測0.30美元）和快速（30-45 min），使其能夠用於SARS-CoV-2變異的人群水平監測。
SARS-CoV-2變體檢測。圖片來源：Nature protocols
與其他方法的比較
最近開發的大部份核酸檢測方法還沒有被設計用於區分病毒變異。此外，也沒有平衡精確度、吞吐量、檢測時間、成本和可用性，以實作SARS-CoV-2變異的人口水平監測。MARVE與其他核酸檢測SARS-CoV-2診斷方法的比較見下表。
下一代測序在辨識新出現的變異和大規模監測方面顯示出良好的能力，但需要實驗室配備體積龐大的器材和專業人員，限制了在實驗室外環境中的可用性。基於核酸擴增檢測，比如RT-qPCR、等溫擴增核酸分析法等方法都需要一個預擴增步驟，從而造成氣溶膠汙染的風險，可能導至假陽性結果。此外，核酸擴增的參與不可避免地增加了檢測時間和成本，以及檢測器材的復雜性。無預擴增核酸檢測已用於診斷COVID-19，如CRISPR-cas13檢測、核酸側流檢測和報告蛋白檢測。這些檢測方法易於執行、快速和經濟有效。然而不能解決病毒基因組中的SNV，不能檢測到SARS-CoV-2變異。
相比之下，MARVE可以分辨基因突變，無需核酸擴增，可以多路復用，易於執行。MARVE原則上能夠檢測到SARS-CoV-2的任何變體。消除預擴增可將檢測時間縮短到45 min以下。該檢測涉及的試劑，如Ag(I)嵌入的DNA探針和脲酶，都很便宜，成本效益高（每次測試0.30美元）。這些特征使MARVE在SARS-CoV-2變異的人群水平監測中非常有前景。
MARVE與其他核酸檢測方法診斷SARS-CoV-2的比較。
圖片來源：Nature protocols
局限性
該方法快速、比RT-qPCR和測序更簡單、更經濟，但也有一些局限性。首先，盡管能夠檢測SNV，但不能篩選病毒基因組中的未知突變。因此被認為是流行病監測測序的補充工具。第二，核酸擴增的消除使MARVE的敏感性低於RT-qPCR，存在無法檢測到病毒載量很低的感染者的風險。但MARVE的檢測限為400個病毒RNA拷貝/μl，足以檢測大多數感染。第三，目前，無提取取樣依賴於熱滅活核酸酶和病毒裂解，需要一個獨立的加熱裝置。第四，該分析涉及紙張折疊步驟。可以探索與基於流體流動控制工具的紙張微流體的整合，以消除紙張折疊過程。最後，在目前的檢測版本中，脲酶需要保持在4°C。冷凍幹燥有延長脲酶在室溫下保存的潛力。
來源: 小桔燈網 | 作者：動力彩虹
