論文薦讀
大腸桿菌合成菸鹼醯胺單核苷酸途徑構建及發酵工藝研究
作者：
程琳1,2,3，龔勁松2，Michael Hall4，蘇暢2，徐國強3，許正宏1,3，史勁松1,2*
單位：
1．江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室
2．江南大學 生命科學與健康工程學院
3．江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心
4．Seragon Biosciences, Inc., CA, Irvine
基金專案：
國家自然基金面上專案（21978116）；江蘇省自然基金（BK20221082）；中央高校基本科研業務費專項資金（JUSRP22047）
摘要&關鍵詞
摘要： β-菸鹼醯胺單核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，NMN）作為人體內重要輔酶NAD+的直接前體受到了廣泛關註，目前工業上主要采用化學法或化學-酶催化法進行合成，發酵法仍未取得突破。為獲得一株高產NMN的工程菌株，對大腸桿菌進行了代謝途徑改造。首先在大腸桿菌中異源表達了來自松噬幾丁質菌（ Chitinophaga pinensis ）的菸鹼醯胺磷酸核糖轉移酶，構建了NMN的補救合成途徑；為增強前體5-磷酸核糖-1-焦磷酸（5-phosphoribose 1-pyrophosphate，PRPP）的供應，過表達了從葡萄糖出發的多個途徑酶，促進了葡萄糖向磷酸戊糖途徑的流動；同時，為有利於NMN積累，透過敲除NMN下遊代謝分解途徑基因 pncC、ushA 以及調控NAD+衍生物基因 nadR ，所獲得的重組菌產量搖瓶水平達到60 mg/L，是初始產量的4.95倍；進一步在5 L罐上進行發酵試驗，產量最高達到390.1 mg/L。該菌株用於NMN的發酵生產具有良好的潛力，後續透過最佳化放大有望進一步提升產量。
關鍵詞： 代謝網絡；基因調控；菸鹼醯胺單核苷酸；5-磷酸核糖1-焦磷酸；發酵工藝
主要結論
為獲得一株高產NMN的工程菌株，本研究以大腸桿菌BL21（DE3）作為表達宿主，透過引入外源松噬幾丁質菌的 Nampt 基因，在大腸桿菌中成功實作了NMN的生物合成。透過強化表達大腸桿菌自身的 zwf、pgl、gnd、ripA、ripB、prs 基因，增強了PRPP途徑的合成能力，有效促進了目標產物NMN的積累。為了使大腸桿菌有效積累產物NMN，敲除了NMN的代謝基因 pncC、ushA 以及衍生物調控因子 nadR ，有效弱化NMN的降解。在此基礎上透過重組菌株的發酵工藝的初步研究，使菌株的搖瓶最高產量為60 mg/L，5 L發酵罐產量達到390.1 mg/L。
圖1 大腸桿菌利用葡萄糖和菸鹼醯胺合成NMN的代謝途徑
Fig. 1 Synthesis of NMN by E. coli using glucose and niacinamide
註：紅色箭頭表示利用質體進行過表達，pncC、ushA、nadR為本研究敲除基因。
a-流加葡萄糖、菸鹼醯胺的發酵過程參數；b-補料培養基、葡萄糖、菸鹼醯胺的發酵過程參數
圖2 重組菌在5 L發酵罐中發酵生產NMN的過程曲線
Fig. 2 Process curve of NMN production by the recombinant strain in 5 L fermenter
本工作透過多種代謝策略提高NMN的發酵產量，最終獲得一株產NMN效能提升的工程菌株，並透過5L小罐的不同發酵方式探究NMN發酵關鍵參數，為有效合成NMN以及工業化生產提供借鑒，後續透過最佳化放大有望進一步提升產量。
團隊介紹
江南大學系統發酵與制藥工程研究室成立於2007年6月，致力於「以重要微生物系統代謝改造與最佳化、復雜微生物群落釀造機理認識與功能調控為抓手，解決飲食與健康的關鍵共性問題」。先後承擔了50余項包括國家重點研發計劃、科技部863重大專案、國家自然基金面上專案、國家科技支撐計劃、江蘇省重大科技成果轉化、江蘇省重點研發計劃、山東省重大關鍵技術專案及企業橫向課題在內的科研專案。獲得國家技術發明二等獎、江蘇省科學技術一等獎、二等獎、天津市科技進步特等獎、中國商業聯合會科技進步一等獎、教育部技術發明二等獎在內的國家級及省部級科技獎勵20余項，在 Biotechnology Advances、Carbohydrate Polymers、ACS Synthetic Biology、ACS Biomaterials Science & Engineering、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Colloids and Surfaces B: Biointerfaces、Critical Reviews in Biotechnology 等生物技術領域權威期刊發表相關論文200余篇，獲得授權國家發明專利170余項、授權美國專利4項、主編或參編科技書籍5部。
通訊作者
史勁松，教授，博士生導師，江蘇省生物醫藥制造工程技術研究中心主任；青藏高原微生物國家地方聯合工程研究中心副主任；首批國家級一流本科課程負責人；生物制藥國家虛擬仿真實驗教學中心負責人。
從事生物制藥方向的科研、教學及生物技術與工程套用領域的實踐工作，主要工作包括：1、醫藥化學品生物制造與藥物的綠色制造，致力於藥物及中間體的生物可替換工藝的開發，涉及藥用胺基酸的發酵、甾體及膽酸類的生物轉化、大分子藥物的分離制備；2、生物活性物質的分離制備和功能評價，主要開展了海洋生物多糖、藥用真菌多糖、藥用植物的生物堿及皂苷、大分子蛋白如角蛋白、膠原蛋白等物質提取、制備和衍生加工，並基於動物模型、細胞模型以及腸道微生物評價體系進行功能評價；3、生物酶的發掘、篩選和套用，面向綠色制藥和生物功能產品的開發，主要開展角蛋白酶、殼聚糖酶、海藻膠裂解酶、甘露聚糖酶、特異性α-糖苷酶、磷脂酶D的宏基因組篩選、分子改造和高表達研究。
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