引言
多能幹細胞(pluripotent stem cells, PSCs)因其能夠分化為多種類別的體細胞而成為再生醫學、疾病模型構建和藥物篩選等領域的研究熱點。 多能幹細胞的狀態可分為幼稚態(naive state)和致敏態(primed state)，其中幼稚態多能幹細胞(nPSCs)具有更強的增殖能力和分化潛能，尤其是在分化為胚外組織時表現更為顯著。這使得nPSCs在研究早期胚胎發育及相關疾病的病理機制方面具有重要價值。
然而， 在體內環境中，nPSCs的存在時間極為短暫，通常僅出現在胚泡(pre-implantation blastocyst)階段，隨後便迅速轉變為致敏態 。為了更好地利用nPSCs進行科學研究，研究人員致力於在體外環境中逆轉和維持這些細胞的幼稚態。然而， 現有的逆轉方法主要依賴於化學小分子和基因工程，這些方法通常操作復雜、成本高昂，且存在潛在的安全風險。因此，開發一種簡單、高效且安全的方法來實作nPSCs的體外逆轉和維持，成為幹細胞研究領域的重要課題。
胚泡的幾何特征在早期胚胎發育中起著至關重要的作用。研究表明，胚泡上胚層(epiblast, Epi)與滋養外胚層(trophectoderm, TE)的界面處呈現出獨特的曲率，這種曲率可能對細胞的機械感知、訊號傳導以及細胞命運決定產生深遠影響。 在胚泡的這一界面上，nPSCs表現出緊密的頂端細胞間接觸，這種接觸由周圍TE層的細胞張力所引發 。因此，研究人員推測，透過在體外培養基底上再現這種特定的幾何微環境，或許能夠透過物理手段逆轉和維持PSCs的幼稚態。
基於這一假設， 研究團隊設計並制造了一種模仿胚泡幾何特征的微結構基底（blastocyst motif substrate, BMS），並透過一系列時空相關分析，驗證了這一基底在誘導和維持小鼠及人類多能幹細胞幼稚態中的有效性 。相關研究發表於8月12日的 Nature Materials 上「 Substrates mimicking the blastocyst geometry revert pluripotent stem cell to naivety 」。研究發現， BMS基底上的微結構單元不僅可以顯著增強細胞間的E-鈣黏蛋白（E-cadherin）/RAC1訊號傳導，還能啟用機械敏感的核轉導因子YAP，進而促進多能性基因的組織蛋白修飾 。這一系列作用機制最終顯著提高了多能性轉錄因子NANOG的表達，並且即使在細胞從基底上移除後，這些效應仍然得以保持。
透過該研究， 研究人員不僅為nPSCs的體外逆轉和維持提供了一種全新的物理方法，也為幹細胞在再生醫學、疾病模型構建和藥物篩選等領域的套用開辟了新的前景 。這一成果為開發更加高效、可延伸的幹細胞培養基底提供了理論基礎和實踐依據，並有望推動幹細胞技術的進一步發展。
目前，大多數逆轉PSCs的方法主要依賴化學小分子或基因工程技術。這些方法通常耗時費力、成本高昂，並且在安全性上存在潛在風險。 因此，研究人員希望透過開發一種基於物理特征的培養基底，以便能夠更簡單、安全地逆轉PSCs並維持其幼稚態。
在胚胎發育早期，胚泡上胚層（epiblast, Epi）和滋養外胚層（trophectoderm, TE）之間的界面呈現出獨特的幾何曲率，這一曲率特征可能對細胞命運的決定產生深遠影響。研究人員設想，模仿這種幾何特征的微結構基底或能透過物理手段有效地將PSCs逆轉至幼稚態。
為驗證這一假設，研究團隊設計並制造了胚泡圖案基底（BMS），並透過一系列的實驗技術對其效果進行了詳細研究。研究方法包括以下幾個步驟：
胚泡幾何特征的分析： 研究團隊首先透過分析小鼠胚泡在E4.25至E4.50發育階段的幾何特征，確定了Epi 的高度、寬度以及Epi-TE界面的曲率範圍（BSCR）。BSCR被定義為15至62 mm-1的曲率範圍，這是研究中用於設計BMS的關鍵參數。
基於胚泡幾何特征設計BMS，並透過細致的計算和分類方法對BMS上的微結構單元進行分析和分類 （Credit: Nature Materials ）
胚泡幾何特征的確定： 展示了小鼠胚泡在E4.25至E4.50發育階段的幾何特征，特別是上胚層(epiblast, Epi)與滋養外胚層(trophectoderm, TE)界面的曲率範圍（BSCR）。研究團隊透過對胚泡幾何特征的計算，確定了Epi層的高度、寬度以及Epi-TE界面的曲率範圍，得出BSCR為15至62 mm^-1。
基底微結構的設計與分類： 基於上述幾何特征，研究團隊設計了包含不同曲率的微結構單元(motifs)的BMS。圖中展示了如何透過計算分析每個微結構單元的曲率值，並將這些曲率值按照凹面、平面和凸面進行分類。每個點的曲率被分為三類：凸面（曲率值≤-2.5 mm^-1）、平面（-2.5 mm^-1 < 曲率值 < 2.5 mm^-1）和凹面（曲率值≥2.5 mm^-1）。BSCR+區域（即曲率值在BSCR範圍內的區域）主要集中在凹面部份。
微結構的分布分析： 圖中還展示了BMS表面不同曲率的分布情況，顯示了BSCR+區域在BMS上的比例約為8%。透過對BMS表面不同曲率區域的統計分析，發現凹面區域中包含較高比例的BSCR+點，這意味著凹面區域的微結構更有可能包含在BSCR範圍內，從而對PSCs的幼稚態逆轉產生影響。
時空相關分析： 圖中最後展示了將BMS表面拓撲圖與時間分辨的細胞影像進行疊加分析的結果。透過這種分析方法，研究團隊能夠追蹤細胞在不同微結構區域內的分布和行為變化，從而進一步了解BSCR+區域在細胞逆轉過程中的作用。
BMS的設計與制造： 基於上述幾何特征，研究團隊設計了包含多個隨機變化微結構單元的BMS，這些微結構單元被稱為「motifs」。BMS透過電火花加工（Electrical Discharge Machining, EDM）在金屬模具表面建立微結構，隨後利用註塑成型技術將這些微結構轉移至聚苯乙烯基底上，從而形成目標BMS。
細胞培養與分析： 研究人員將小鼠和人類的PSCs培養在BMS上，並與傳統平面基底上的細胞進行對比。他們透過時間分辨的顯微鏡成像技術，結合基底的幾何特征資訊，分析了不同曲率的微結構對PSCs的影響。此外，研究團隊還利用熒光標記和定量PCR等分子生物學技術檢測了細胞中多能性標誌物（如NANOG、STELLA）的表達水平。
細胞訊號傳導的研究： 為探討BSCR在PSCs逆轉過程中的機制作用，研究團隊進一步分析了細胞間的訊號傳導情況，特別是E-鈣黏蛋白（E-cadherin）/RAC1訊號傳導以及機械敏感核轉導因子YAP的啟用情況。
研究結果顯示，培養在BMS上的PSCs表現出了顯著的幼稚態逆轉特征。
幼稚態多能幹細胞的比例顯著增加
在BSCR+區域（曲率範圍為15-62 mm-1）內，PSCs顯示出更高的NANOG和STELLA表達水平，且幼稚態多能幹細胞的比例顯著增加。這表明，BSCR+區域內的微結構能夠有效促進PSCs向幼稚態的逆轉。
細胞訊號傳導的增強
研究表明，BSCR+區域內的PSCs表現出更強的E-鈣黏蛋白（E-cadherin）/RAC1訊號傳導。這種訊號傳導不僅增強了細胞間的粘附力，還透過啟用機械敏感的核轉導因子YAP，進一步推動了多能性基因的組織蛋白修飾（如pK27me3和pK4me3的變化）。這些組織蛋白修飾最終導致了NANOG等多能性轉錄因子的表達水平顯著提高，並且這種效應在細胞從基底上移除後仍然能夠持續數天。
BMS基底透過BSCR區域有效促進PSCs的幼稚態逆轉 （Credit: Nature Materials ）
多能性標誌物的表達水平： 圖a展示了在不同基底（包括傳統平面基底和BMS基底）上培養的多能幹細胞（PSCs）中，多個幼稚態多能性標誌物（如NANOG、STELLA、OCT4、SSEA1）的表達水平。研究結果顯示，在BMS基底上培養的PSCs，其NANOG和STELLA等幼稚態標誌物的表達水平顯著高於在傳統平面基底上培養的PSCs。相反，ZIC2（一種致敏態標誌物）的表達在BMS基底上顯著降低，這表明BMS基底能夠有效促進PSCs的幼稚態逆轉。
幼稚態多能幹細胞的分布： 圖b展示了在BMS基底上培養的PSCs中，幼稚態細胞（標記為NANOG高表達和STELLA高表達細胞）的空間分布情況。結果顯示，在BMS的凹面區域（特別是包含BSCR+區域的凹面）中，幼稚態細胞的比例顯著高於其他區域，表明BSCR+區域在促進PSCs逆轉至幼稚態方面具有重要作用。
BSCR對幼稚態逆轉的影響： 圖c和d進一步量化了在不同類別微結構（凸面、平面和凹面）以及不同BSCR計數（BSCR-low、BSCR-med、BSCR-hi）區域內，幼稚態細胞的比例。結果表明，隨著BSCR計數的增加，幼稚態細胞的比例顯著升高，尤其是在凹面區域內。這表明，BSCR在誘導PSCs逆轉至幼稚態中起到了關鍵作用。
BSCR計數與幼稚態的相關性： 圖e和f進一步分析了不同BSCR計數（即在特定微結構區域內，符合BSCR曲率範圍的方向數量）與幼稚態細胞比例之間的關系。研究發現，隨著BSCR計數的增加，NANOG高表達和STELLA高表達的幼稚態細胞比例也隨之顯著提高。這一結果進一步支持了BSCR是影響PSCs逆轉至幼稚態的重要幾何參數。
細胞遷移和分布的變化
實驗還發現，在BSCR+區域內的PSCs，其細胞遷移距離較短，並且在基底上的分布更為均勻，顯示出對這一特定幾何環境的依賴性。相反，在BSCR-區域或傳統平面基底上的PSCs則表現出較高的細胞遷移性和更低的幼稚態比例。
BSCR區域如何在體外實驗中誘導PSCs原位逆轉至幼稚態 （Credit: Nature Materials ）
早期細胞與BMS的相互作用： 圖a-d展示了在細胞接種到BMS基底上9小時後的早期相互作用。研究結果表明，PSCs在BSCR+區域（即符合BSCR曲率範圍的區域）內隨機分布，且與BSCR-區域相比，細胞密度、NANOG表達水平以及細胞大小沒有顯著差異。這表明在早期階段，BSCR+和BSCR-區域的PSCs沒有表現出顯著的表型差異。
幼稚態標誌物的動態變化： 圖e展示了PSCs在不同基底（傳統平面基底和BMS基底）上NANOG-GFP表達的動態變化。研究結果顯示，在BSCR+區域內，NANOG-GFP訊號在細胞接種後的21小時內逐漸增加，表明BSCR+區域能夠有效誘導PSCs向幼稚態逆轉。此外，實驗還透過追蹤單個細胞的遷移路徑，確認了幼稚態逆轉是在BSCR+區域內原位發生的，而不是由於遠距離遷移導致的。
細胞遷移與幼稚態逆轉的關系： 圖f透過追蹤細胞的遷移路徑，進一步分析了BSCR+和BSCR-區域內PSCs的遷移行為。結果顯示，從BSCR+區域向BSCR-區域的細胞遷移事件較為罕見，而大多數細胞在BSCR+區域內保持穩定。這一結果支持了PSCs的幼稚態逆轉主要發生在BSCR+區域，而不是透過細胞遷移實作的。
幼稚態逆轉的時間依賴性： 實驗透過時間分辨的成像技術，追蹤了PSCs在BMS基底上數天內的動態變化。結果顯示，BSCR+區域內的幼稚態細胞比例在接種後第1天和第3天顯著增加，並且與BSCR-區域相比，幼稚態細胞的比例保持較高。這表明BSCR+區域不僅能夠迅速誘導PSCs的幼稚態逆轉，還能夠在一定時間內維持這一狀態。
物理特征對細胞命運的決定性作用
透過將PSCs培養在不同形狀的微結構基底上，研究進一步驗證了BSCR的關鍵作用。即使在非對稱的微結構（如微溝槽）上，只要具備BSCR特征，也能有效誘導PSCs的幼稚態逆轉。這說明，BSCR是決定細胞命運的幾何參數，其對細胞命運的影響獨立於微結構的具體形狀。
這項研究透過模仿胚泡的幾何特征，成功開發了一種新型的幹細胞培養基底，為幹細胞研究和套用提供了新的工具和方法。 與現有的化學或基因操作方法相比，BMS基底不僅設計簡單，成本低廉，且能夠在更短時間內有效誘導PSCs逆轉至幼稚態。 更重要的是，這一基底設計的理念具有廣泛的適用性，不僅可以套用於小鼠PSCs，還為未來人類PSCs的逆轉提供了潛在的解決方案。
未來，這一研究成果有望在再生醫學、疾病模型構建、藥物篩選以及個人化醫療等領域得到廣泛套用。例如，透過使用BMS基底，可以更加高效地生成具備高發育潛能的多能幹細胞，這將為器官再生、基因治療以及幹細胞移植等技術的發展提供重要支持。此外，研究還可以進一步擴充套件這一基底的套用範圍，探索其在其他類別幹細胞上的效果，並最佳化基底的設計以適應不同的研究需求。
總之，該研究透過結合胚泡幾何特征和現代生物技術，開創了一種全新的幹細胞培養方法，為科學家們提供了更為高效和安全的實驗工具。隨著研究的深入和技術的不斷完善，這一成果必將推動幹細胞技術的發展，為人類健康帶來更多福祉。
參考文獻
Xu X, Wang W, Liu Y, Bäckemo J, Heuchel M, Wang W, Nie Y, Iqbal I, Kratz K, Lendlein A, Ma N. Substrates mimicking the blastocyst geometry revert pluripotent stem cell to naivety. Nat Mater. 2024 Aug 12. doi: 10.1038/s41563-024-01971-4. Epub ahead of print. PMID: 39134648.
https://www.nature.com/articles/s41563-024-01971-4
責編 |探索君
排版|探索君
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