中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準
SN/T 5481-2022
進出口食用動物、飼料中慶大黴素檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法
Determination of Gentamycin in edible animal and feeds for import and export-LC-MS/MS
前言
本檔按照GB/T 1.1- 2020【標準化工作導則第1 部份：標準化檔的結構和起草規則】的規定起草。
本檔由中華人民共和國海關總署提出並歸口。
本檔起草單位：中華人民共和國成都海關。
本檔主要起草人：於剛、譚誌、李永麗、何開蓉、俞淩雲、肖宇、林華、李丹丹。
1範圍
本檔規定了食用動物、飼料中慶大黴素殘留量的液相色譜質譜/質譜測定方法。
本檔適用於進出口工作中牛、豬、羊、雞的血清，牛、豬、羊的尿液和豬飼料中慶大黴素的檢測。
2規範性參照檔
下列檔中的內容透過文中的規範性參照而構成本檔必不可少的條款。其中，註日期的參照檔；僅該日期對應的版本適用於本檔；不註日期的參照檔，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本檔。
GB/T 6682分析實驗室用水規格和試驗方法
3術語和定義
本檔沒有需要界定的術語和定義。
4試劑和材料
除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。
4.1 甲醇：色譜純。
4.2乙腈：色譜純。
4.3三氯乙酸：優級純。
4.4七氟丁酸（Heptafluorobutyric acid，HFBA）：HPLC級。
4.5 甲酸：色譜純。
4.6 標準物質：慶大黴素硫酸鹽（C19p9N5O7·pSO4），含量高於99.0%。
4.7 標準儲備溶液：1.0 mg/mL。稱取4.6所述標準物質適量，用水配成1.0 mg/mL的標準儲備溶液於塑膠容量瓶中，2℃~8℃保存。
4.8 標準工作溶液（10.0 μg/mL）：吸取4.7所述各標準儲備溶液1 mL於100 mL塑膠容量瓶中，用水定容至刻度，2℃~8℃保存。
4.9 三氯乙酸溶液（5%）：稱取三氯乙酸10.0 g，用水200 mL，溶解（常溫下保存2個月）。
4. 10 七氟丁酸（HFBA）水溶液（500 mmol/L）：準確量取12.8 mL七氟丁酸，用水稀釋至200 mL（4℃避光保存，有效期1個月）。
4. 11 七氟丁酸（HFBA）水溶液（50 mmol/L）：準確量取4.10中七氟丁酸溶液10 mL，用水稀釋至100 mL（4℃避光保存，有效期1個月）。
4.12 七氟丁酸（HFBA）水溶液（5 mmol/L）：準確量取4.11中七氟丁酸溶液10 mL，用水稀釋至100 mL（4℃避光保存，有效期1個月）。
4.13七氟丁酸（ HFBA）水溶液（10 mmol/L）：準確量取50 mmol/L七氟丁酸溶液10 mL，用水稀釋至100mL。
4.14 HLB固相萃取柱 （60 mg/3 mL）。
4.15 0.22μm水相濾膜。
5儀器器材
5.1 液相色譜串聯質譜儀：配有電噴霧離子源。
5.2 天平：感量分別為0.01 g和0.000 1 g。
5.3氮吹濃縮儀。
5.4 高速冷凍離心機（最高轉速可達15 000 r/min）。
5.5 固相萃取裝置。
6樣品的采集與保存
6.1血樣的采集
采集動物血樣約10 mL，待自然凝固後分離血清，分裝於聚四氟乙烯材質小管，加蓋密封。
6.2 尿樣的采集
采集動物尿樣約10 mL，12 000 r/min離心10 min後，上清液分裝於聚四氟乙烯材質小管，加蓋密封。
6.3 飼料試樣
采集飼料樣品約500g。在實驗室粉碎混勻，四分法至約20 g後分裝於小塑膠袋，密封。
6.4試樣的保存
將分裝後的血情、尿樣於-20℃保存，飼料樣品於4℃保存。
7測定步驟
7.1 提取
7.1.1血清和尿樣試樣
稱取約2 g血清或尿樣（精確至0.01 g）於50 mL離心管中，加入3 mL三氯乙酸溶液（4.9）.渦旋振蕩1 min，在4℃下10000 r/min離心5 min，取上清液置於15 mL離心管中。用2 mL三氯乙酸溶液重復提取1次，合並提取液，加2 mL七氟丁酸（HFBA）水溶液（4.11），混勻，備用。
7.1.2飼料試樣
稱取約2 g試樣（精確至0.01 g），加入5 mL 三氯乙酸溶液（4.9），渦旋振蕩3 min，在4℃下以10 000 r/min離心5 min，取上清液層置於15 mL塑膠離心管中。用5 mL三氯乙酸溶液（4.9）重復提取1次，合並提取液，加2 mL七氟丁酸（HFBA）水溶液（4.11），混勻，備用。
7.2凈化
固相萃取柱（HLB）（4.14）依次用甲醇、水、七氟丁酸（ HFBA）水溶液（4. 12）各3 mL活化，取備用液上柱，用水5 mL淋洗，甲醇3 mL洗脫，收集洗脫液於塑膠離心管中，置於40℃水浴中輕微氮氣流吹幹，用七氟丁酸（HFBA）水溶液（4.12）1.0 mL溶解殘渣，經0.22 μm濾膜過濾後，待測。
7.3基質工作曲線的配制
取空白試樣（不含有慶大黴素的動物生物樣品或飼料），按7.1和7.2進行提取凈化，獲得基質提取液。分別吸取適量標準工作溶液（4.8），依次加入相應試劑瓶中，用基質提取液定容至1.0 mL獲得0.05 mg/L、0.2 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和5.0 mg/L的系列基質標準工作溶液。
7.4測定條件
7.4.1液相色譜質譜參考條件
7.4. 1.1 色譜柱：C18，3μm，2.1×100 mm ，或相當者。
7.4. 1.2流速：0.3 mL/min。
7.4.1.3 柱溫箱溫度：35℃。
7.4.1.4 進樣量：5 μL。
7.4. 1.5 流動相：10 mmol/L HFBA水溶液（A）和乙腈（B）。梯度洗脫條件見表1。
7.4.1.6 離子源：電噴霧離子源。
7.4.1.7 掃描方式：正離子掃描。
7. 4. 1.8 檢測方式：多反應監測。
7.4.1.9 電噴霧電壓：5 500 V。
7.4.1.10 氣簾氣壓力：20 psi。
7.4.1.11 輔肋氣壓力：GAS1.60 psi；GAS2.60 psi。
7.4.1.12 離子源溫度：550℃。
7.4. 1.13 定性離子對、定量離子對、去簇電壓、碰撞能量，見表2。
7.4.2 測定
7.4.2.1定性測定
在相同試驗條件下，樣品溶液中的被測物的保留時間與基質標準工作溶液中被測物的保留時間比值，偏差在±2.5%之內。待測樣品溶液中，被測物中各定性離子相對豐度與濃度接近的基質標準工作溶液中被測物的各定性離子相對豐度的比值，若偏差不超過表3規定的範圍，則可判定為樣品中存在慶大黴素。
7. 4.2.2 定量測定
在相同的儀器工作條件下，以基質標準溶液中被測組分峰面積為縱座標，以對應的標準溶液濃度（mg/L）為橫座標，繪制標準工作曲線。用標準工作曲線對樣品進行定量，應使樣品溶液中慶大黴素的響應值在儀器測定的線性範圍內。在上述色譜和質譜條件下，慶大黴素（組分C1）的提取離於色譜圖見附錄A。
7.5空白試驗
除不加試樣溶液外，均按上述操作步驟進行。
8結果計算
慶大黴素的含量用色譜數據處理軟件外標法計算或按式（1）計算：
式中：
X——試料中慶大黴素殘留量，單位為亳克每千克（mg/kg）；
A——試樣溶液中慶大黴素的峰面積；
Cs——標準工作液中慶大黴素的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；
V——溶解殘余物所得試樣溶液體積，單位為亳升（mL）；
As——標準工作液中慶大黴素的峰面積；
W——樣品質素，單位為克（g）。
9檢測限、定量限、回收率和精密度
9.1 檢測限和定量限
本方法對血清、尿樣和豬飼料中慶大黴素的檢測限為0.025 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。
9.2回收率和精密度
牛、豬、羊和雞血清，牛、豬、羊尿液和豬飼料中慶大黴素類藥物的添加回收率和精密度見附錄B。
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