引言
多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)因其能够分化为多种类型的体细胞而成为再生医学、疾病模型构建和药物筛选等领域的研究热点。 多能干细胞的状态可分为幼稚态(naive state)和致敏态(primed state)，其中幼稚态多能干细胞(nPSCs)具有更强的增殖能力和分化潜能，尤其是在分化为胚外组织时表现更为显著。这使得nPSCs在研究早期胚胎发育及相关疾病的病理机制方面具有重要价值。
然而， 在体内环境中，nPSCs的存在时间极为短暂，通常仅出现在胚泡(pre-implantation blastocyst)阶段，随后便迅速转变为致敏态 。为了更好地利用nPSCs进行科学研究，研究人员致力于在体外环境中逆转和维持这些细胞的幼稚态。然而， 现有的逆转方法主要依赖于化学小分子和基因工程，这些方法通常操作复杂、成本高昂，且存在潜在的安全风险。因此，开发一种简单、高效且安全的方法来实现nPSCs的体外逆转和维持，成为干细胞研究领域的重要课题。
胚泡的几何特征在早期胚胎发育中起着至关重要的作用。研究表明，胚泡上胚层(epiblast, Epi)与滋养外胚层(trophectoderm, TE)的界面处呈现出独特的曲率，这种曲率可能对细胞的机械感知、信号传导以及细胞命运决定产生深远影响。 在胚泡的这一界面上，nPSCs表现出紧密的顶端细胞间接触，这种接触由周围TE层的细胞张力所引发 。因此，研究人员推测，通过在体外培养基底上再现这种特定的几何微环境，或许能够通过物理手段逆转和维持PSCs的幼稚态。
基于这一假设， 研究团队设计并制造了一种模仿胚泡几何特征的微结构基底（blastocyst motif substrate, BMS），并通过一系列时空相关分析，验证了这一基底在诱导和维持小鼠及人类多能干细胞幼稚态中的有效性 。相关研究发表于8月12日的 Nature Materials 上「 Substrates mimicking the blastocyst geometry revert pluripotent stem cell to naivety 」。研究发现， BMS基底上的微结构单元不仅可以显著增强细胞间的E-钙黏蛋白（E-cadherin）/RAC1信号传导，还能激活机械敏感的核转导因子YAP，进而促进多能性基因的组蛋白修饰 。这一系列作用机制最终显著提高了多能性转录因子NANOG的表达，并且即使在细胞从基底上移除后，这些效应仍然得以保持。
通过该研究， 研究人员不仅为nPSCs的体外逆转和维持提供了一种全新的物理方法，也为干细胞在再生医学、疾病模型构建和药物筛选等领域的应用开辟了新的前景 。这一成果为开发更加高效、可扩展的干细胞培养基底提供了理论基础和实践依据，并有望推动干细胞技术的进一步发展。
目前，大多数逆转PSCs的方法主要依赖化学小分子或基因工程技术。这些方法通常耗时费力、成本高昂，并且在安全性上存在潜在风险。 因此，研究人员希望通过开发一种基于物理特征的培养基底，以便能够更简单、安全地逆转PSCs并维持其幼稚态。
在胚胎发育早期，胚泡上胚层（epiblast, Epi）和滋养外胚层（trophectoderm, TE）之间的界面呈现出独特的几何曲率，这一曲率特征可能对细胞命运的决定产生深远影响。研究人员设想，模仿这种几何特征的微结构基底或能通过物理手段有效地将PSCs逆转至幼稚态。
为验证这一假设，研究团队设计并制造了胚泡图案基底（BMS），并通过一系列的实验技术对其效果进行了详细研究。研究方法包括以下几个步骤：
胚泡几何特征的分析： 研究团队首先通过分析小鼠胚泡在E4.25至E4.50发育阶段的几何特征，确定了Epi 的高度、宽度以及Epi-TE界面的曲率范围（BSCR）。BSCR被定义为15至62 mm-1的曲率范围，这是研究中用于设计BMS的关键参数。
基于胚泡几何特征设计BMS，并通过细致的计算和分类方法对BMS上的微结构单元进行分析和分类 （Credit: Nature Materials ）
胚泡几何特征的确定： 展示了小鼠胚泡在E4.25至E4.50发育阶段的几何特征，特别是上胚层(epiblast, Epi)与滋养外胚层(trophectoderm, TE)界面的曲率范围（BSCR）。研究团队通过对胚泡几何特征的计算，确定了Epi层的高度、宽度以及Epi-TE界面的曲率范围，得出BSCR为15至62 mm^-1。
基底微结构的设计与分类： 基于上述几何特征，研究团队设计了包含不同曲率的微结构单元(motifs)的BMS。图中展示了如何通过计算分析每个微结构单元的曲率值，并将这些曲率值按照凹面、平面和凸面进行分类。每个点的曲率被分为三类：凸面（曲率值≤-2.5 mm^-1）、平面（-2.5 mm^-1 < 曲率值 < 2.5 mm^-1）和凹面（曲率值≥2.5 mm^-1）。BSCR+区域（即曲率值在BSCR范围内的区域）主要集中在凹面部分。
微结构的分布分析： 图中还展示了BMS表面不同曲率的分布情况，显示了BSCR+区域在BMS上的比例约为8%。通过对BMS表面不同曲率区域的统计分析，发现凹面区域中包含较高比例的BSCR+点，这意味着凹面区域的微结构更有可能包含在BSCR范围内，从而对PSCs的幼稚态逆转产生影响。
时空相关分析： 图中最后展示了将BMS表面拓扑图与时间分辨的细胞图像进行叠加分析的结果。通过这种分析方法，研究团队能够追踪细胞在不同微结构区域内的分布和行为变化，从而进一步了解BSCR+区域在细胞逆转过程中的作用。
BMS的设计与制造： 基于上述几何特征，研究团队设计了包含多个随机变化微结构单元的BMS，这些微结构单元被称为「motifs」。BMS通过电火花加工（Electrical Discharge Machining, EDM）在金属模具表面创建微结构，随后利用注塑成型技术将这些微结构转移至聚苯乙烯基底上，从而形成目标BMS。
细胞培养与分析： 研究人员将小鼠和人类的PSCs培养在BMS上，并与传统平面基底上的细胞进行对比。他们通过时间分辨的显微镜成像技术，结合基底的几何特征信息，分析了不同曲率的微结构对PSCs的影响。此外，研究团队还利用荧光标记和定量PCR等分子生物学技术检测了细胞中多能性标志物（如NANOG、STELLA）的表达水平。
细胞信号传导的研究： 为探讨BSCR在PSCs逆转过程中的机制作用，研究团队进一步分析了细胞间的信号传导情况，特别是E-钙黏蛋白（E-cadherin）/RAC1信号传导以及机械敏感核转导因子YAP的激活情况。
研究结果显示，培养在BMS上的PSCs表现出了显著的幼稚态逆转特征。
幼稚态多能干细胞的比例显著增加
在BSCR+区域（曲率范围为15-62 mm-1）内，PSCs显示出更高的NANOG和STELLA表达水平，且幼稚态多能干细胞的比例显著增加。这表明，BSCR+区域内的微结构能够有效促进PSCs向幼稚态的逆转。
细胞信号传导的增强
研究表明，BSCR+区域内的PSCs表现出更强的E-钙黏蛋白（E-cadherin）/RAC1信号传导。这种信号传导不仅增强了细胞间的粘附力，还通过激活机械敏感的核转导因子YAP，进一步推动了多能性基因的组蛋白修饰（如pK27me3和pK4me3的变化）。这些组蛋白修饰最终导致了NANOG等多能性转录因子的表达水平显著提高，并且这种效应在细胞从基底上移除后仍然能够持续数天。
BMS基底通过BSCR区域有效促进PSCs的幼稚态逆转 （Credit: Nature Materials ）
多能性标志物的表达水平： 图a展示了在不同基底（包括传统平面基底和BMS基底）上培养的多能干细胞（PSCs）中，多个幼稚态多能性标志物（如NANOG、STELLA、OCT4、SSEA1）的表达水平。研究结果显示，在BMS基底上培养的PSCs，其NANOG和STELLA等幼稚态标志物的表达水平显著高于在传统平面基底上培养的PSCs。相反，ZIC2（一种致敏态标志物）的表达在BMS基底上显著降低，这表明BMS基底能够有效促进PSCs的幼稚态逆转。
幼稚态多能干细胞的分布： 图b展示了在BMS基底上培养的PSCs中，幼稚态细胞（标记为NANOG高表达和STELLA高表达细胞）的空间分布情况。结果显示，在BMS的凹面区域（特别是包含BSCR+区域的凹面）中，幼稚态细胞的比例显著高于其他区域，表明BSCR+区域在促进PSCs逆转至幼稚态方面具有重要作用。
BSCR对幼稚态逆转的影响： 图c和d进一步量化了在不同类型微结构（凸面、平面和凹面）以及不同BSCR计数（BSCR-low、BSCR-med、BSCR-hi）区域内，幼稚态细胞的比例。结果表明，随着BSCR计数的增加，幼稚态细胞的比例显著升高，尤其是在凹面区域内。这表明，BSCR在诱导PSCs逆转至幼稚态中起到了关键作用。
BSCR计数与幼稚态的相关性： 图e和f进一步分析了不同BSCR计数（即在特定微结构区域内，符合BSCR曲率范围的方向数量）与幼稚态细胞比例之间的关系。研究发现，随着BSCR计数的增加，NANOG高表达和STELLA高表达的幼稚态细胞比例也随之显著提高。这一结果进一步支持了BSCR是影响PSCs逆转至幼稚态的重要几何参数。
细胞迁移和分布的变化
实验还发现，在BSCR+区域内的PSCs，其细胞迁移距离较短，并且在基底上的分布更为均匀，显示出对这一特定几何环境的依赖性。相反，在BSCR-区域或传统平面基底上的PSCs则表现出较高的细胞迁移性和更低的幼稚态比例。
BSCR区域如何在体外实验中诱导PSCs原位逆转至幼稚态 （Credit: Nature Materials ）
早期细胞与BMS的相互作用： 图a-d展示了在细胞接种到BMS基底上9小时后的早期相互作用。研究结果表明，PSCs在BSCR+区域（即符合BSCR曲率范围的区域）内随机分布，且与BSCR-区域相比，细胞密度、NANOG表达水平以及细胞大小没有显著差异。这表明在早期阶段，BSCR+和BSCR-区域的PSCs没有表现出显著的表型差异。
幼稚态标志物的动态变化： 图e展示了PSCs在不同基底（传统平面基底和BMS基底）上NANOG-GFP表达的动态变化。研究结果显示，在BSCR+区域内，NANOG-GFP信号在细胞接种后的21小时内逐渐增加，表明BSCR+区域能够有效诱导PSCs向幼稚态逆转。此外，实验还通过追踪单个细胞的迁移路径，确认了幼稚态逆转是在BSCR+区域内原位发生的，而不是由于远距离迁移导致的。
细胞迁移与幼稚态逆转的关系： 图f通过追踪细胞的迁移路径，进一步分析了BSCR+和BSCR-区域内PSCs的迁移行为。结果显示，从BSCR+区域向BSCR-区域的细胞迁移事件较为罕见，而大多数细胞在BSCR+区域内保持稳定。这一结果支持了PSCs的幼稚态逆转主要发生在BSCR+区域，而不是通过细胞迁移实现的。
幼稚态逆转的时间依赖性： 实验通过时间分辨的成像技术，追踪了PSCs在BMS基底上数天内的动态变化。结果显示，BSCR+区域内的幼稚态细胞比例在接种后第1天和第3天显著增加，并且与BSCR-区域相比，幼稚态细胞的比例保持较高。这表明BSCR+区域不仅能够迅速诱导PSCs的幼稚态逆转，还能够在一定时间内维持这一状态。
物理特征对细胞命运的决定性作用
通过将PSCs培养在不同形状的微结构基底上，研究进一步验证了BSCR的关键作用。即使在非对称的微结构（如微沟槽）上，只要具备BSCR特征，也能有效诱导PSCs的幼稚态逆转。这说明，BSCR是决定细胞命运的几何参数，其对细胞命运的影响独立于微结构的具体形状。
这项研究通过模仿胚泡的几何特征，成功开发了一种新型的干细胞培养基底，为干细胞研究和应用提供了新的工具和方法。 与现有的化学或基因操作方法相比，BMS基底不仅设计简单，成本低廉，且能够在更短时间内有效诱导PSCs逆转至幼稚态。 更重要的是，这一基底设计的理念具有广泛的适用性，不仅可以应用于小鼠PSCs，还为未来人类PSCs的逆转提供了潜在的解决方案。
未来，这一研究成果有望在再生医学、疾病模型构建、药物筛选以及个性化医疗等领域得到广泛应用。例如，通过使用BMS基底，可以更加高效地生成具备高发育潜能的多能干细胞，这将为器官再生、基因治疗以及干细胞移植等技术的发展提供重要支持。此外，研究还可以进一步扩展这一基底的应用范围，探索其在其他类型干细胞上的效果，并优化基底的设计以适应不同的研究需求。
总之，该研究通过结合胚泡几何特征和现代生物技术，开创了一种全新的干细胞培养方法，为科学家们提供了更为高效和安全的实验工具。随着研究的深入和技术的不断完善，这一成果必将推动干细胞技术的发展，为人类健康带来更多福祉。
参考文献
Xu X, Wang W, Liu Y, Bäckemo J, Heuchel M, Wang W, Nie Y, Iqbal I, Kratz K, Lendlein A, Ma N. Substrates mimicking the blastocyst geometry revert pluripotent stem cell to naivety. Nat Mater. 2024 Aug 12. doi: 10.1038/s41563-024-01971-4. Epub ahead of print. PMID: 39134648.
https://www.nature.com/articles/s41563-024-01971-4
责编 |探索君
排版|探索君
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