一. 單細胞篩選的意義
（1）生物藥開發是一個非常復雜的過程，而構建適用於工業生產的高表達的穩定細胞株是生物藥工藝開發的起點和基礎，後續開發、臨床前和臨床工作都是基於某一確定的細胞株進行開展的。
（2）用於表達治療性蛋白的工程細胞需要來源於同一原始細胞，原因在於工程細胞的單複制源性是產品的品質、表達量穩定性的必要條件。
（3）食品藥品監督管理局（FDA）的政策和法規都強制要求生物制藥企業提供清晰圖片證據以證明單複制抗體研發過程中的單複制源性。
（4）減少細胞庫的異質性，減少單複制細胞篩選的復雜流程，保持生產過程的一致性和可預見性，確保最終產品的產量和品質在預設的範圍內。
二. 細胞株構建
細胞株構建包含轉染、篩選細胞群、單複制化、篩選單複制等步驟。
細胞株構建流程
三. 單複制成像
在提供單複制證據方面，單複制成像技術的出現具有重要意義。不同於機率計算和統計，單複制成像系統提供直接的影像證據，是目前可以確定單複制的可靠方法。
單複制成像技術
但還存在著一些問題：成像系統的解析度，能不能全孔清晰成像，尤其是邊緣細胞不能清晰成像是一個問題；其次是液面高度，成像系統一般是對底面成像，所以細胞只有在底面才可能清晰成像；另外孔板間差異也對成像系統提出挑戰，微孔板不是一個絕對的平面，為了能夠拍清楚微孔板底部的細胞，成像系統最好能夠進行逐孔聚焦成像。
四. 單細胞篩選方法
單細胞篩選方法主要有7種，包括有限稀釋法、高通量細胞複制篩選系統、流式細胞熒光分選技術、單細胞打印技術、口吸管技術、雷射捕獲顯微切割技術、MACS磁珠分選技術。
單細胞篩選方法
有限稀釋法是常用的篩選方法，這是一種比較難給出一個通用的單複制形成率，需多輪實驗獲得高單複制率的方法。
優勢：低成本、易於操作，對儀器裝置的需求比較少，與成像系統關聯使用
劣勢：效率較低，對人工依賴較高，實驗結果差異大，需大量實驗篩選
註意事項：
① 細胞聚團情況, 細胞聚團會降低單複制的機率。
② 0.5cells/孔鋪板, 按卜瓦松分布可計算細胞數為0的孔比例應該是 61%, 但事實上複制的長出率變動很大, 其比例可從10%到98%, 這主要和細胞活率、篩選壓力及培養條件等因素有關。
③ 若需檢查細胞數目, 可在鋪板第0天1～2 h細胞自然沈降 (也可透過離心微孔板加速此過程) 後鏡檢微孔板, 采用自動成像裝置記錄孔內的細胞數目, 分析其卜瓦松分布的適合度。
④ 可連續多天檢查孔中細胞的生長和倍增情況, 並進行比對分析; 必要時應檢查鋪板前的空板, 以排除假訊號。
五. 單複制源性驗證
在申報IND的時候需要送出關於細胞株複制過程的描述以及單複制源性證據。
（1）High probability：一輪細胞複制加孔板照相可以滿足單複制源性要求。
鋪板方法可以是有限稀釋（鋪板密度≤0.5cell/well，實際操作中，考慮操作誤差一般低於0.5cell/well）。孔板照相需要在第0天，拍攝清晰的單個細胞存在，在第1天和第2天再次拍照捕捉細胞分裂過程。
（2）Low probability + High Assurance：根據複制細胞獨特的遺傳學特征分析外源基因整合位點。整合位點的分析方法主要有如下幾種：
（a) 熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization，FISH）
（b) Southern Blot：kb級DNA檢測水平
（c) Junction PCR：bp級DNA檢測水平
（d) 下一代測序技術（next-generation sequencing technology，NGS）
作者：海星生物
公眾號：海星生物科技
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