中華人民共和國農業行業標準
NY/T 4360-2023
飼料中鏈黴素、雙氫鏈黴素和康黴素的測定 液相色譜-串聯質譜法
Determination of streptomycin， dihydrostreptomycin and kanamycin in feeds-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本檔按照GB/T 1.1-2020【標準化工作導則第 1部份：標準化檔的結構和起草規則】的規定起草。
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本檔由農業農村部畜牧獸醫局提出。
本檔由全國飼料工業標準化技術委員會（SAC/TC 76）歸口。
本檔起草單位：江蘇省農業科學院。
本檔主要起草人：魏瑞成、欒楓婷、王冉、龔蘭、何濤、朱磊、唐敏敏。
1範圍
本檔描述了飼料中鏈黴素、雙氫鏈黴素和康黴素的液相色譜-串聯質譜測定方法。
本檔適用於配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和添加劑預混合飼料中鏈黴素、雙氫鏈黴素和康黴素的測定。
本檔的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg。
2規範性參照檔
下列檔中的內容透過文中的規範性參照而構成本檔必不可少的條款。其中，註日期的參照檔，僅該日期對應的版本適用於本檔；不註日期的參照檔，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本檔。
GB/T 6682分析實驗室用水規格和試驗方法
GB/T 20195 動物飼料 試樣的制備
3術語和定義
本檔沒有需要界定的術語和定義。
4原理
試樣中的鏈黴素、雙氫鏈黴素和康黴素用混合提取溶液提取，經親水-親脂平衡型固相萃取柱凈化，用液相色譜-串聯質譜儀檢測，基質匹配標準遊液校準，外標被定量。
5試劑或材料
除非另有規定，僅使用分析純試劑。與鏈黴素、雙氫鏈黴素和康黴素溶液接觸的容器應使用聚丙烯材質。
5.1水：GB/T 6682，一級。
5.2甲醇：色譜純。
5.3乙腈：色譜純。
5.4甲酸：色譜純。
5.5乙酸銨：色譜純。
5.6異丙醇：色譜純。
5.7磷酸二氫鉀溶液（0.2 mol/L）：稱取2.72 g磷酸二氫鉀，加水溶解並稀釋至100 mL，混勻。
5.8乙二胺四乙酸二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取6.72 g乙二胺四乙酸二鈉，加水溶解並稀釋至100 mL，混勻。
5.9 20%三氯乙酸溶液：稱取200 g三氯乙酸，加水溶解並稀釋至1 000 mL，混勻。
5.10 混合提取溶液：量取50 mL磷酸二氫鉀溶液（5.7）、10 mL乙二胺四乙酸二鈉溶液（5.8）和500 mL三氯乙酸溶液（5.9），加水至900 mL，混勾，用氨水調節pH至7.50±0.20，用水稀釋、定容至1 000 mL， 混勻。
5.11 10%甲醇溶液：取10 mL甲醇（5.2），加水稀釋至100 mL，混勻。
5.12乙酸銨溶液（0.1 mol/L）：稱取0.77 g乙酸銨（5.5），加水溶解並稀釋至100 mL，混勻。
5.13乙酸銨溶液（0. 002 mol/L） ：移取2 mL乙酸銨溶液（5.12） ，加水稀釋至100 mL，混勻。
5.14洗脫溶液：取10 mL甲酸（5.4）、5 mL異丙醇（5.6）和85 mL乙酸銨溶液（5.13）混合，用甲酸調節pH至0.80±0.10，混勻。
5.15乙酸銨-甲酸溶液：移取10 mL乙酸銨溶液（5.12）、5 mL甲酸（5.4） ，用水稀釋並定容至500 mL混勻。
5.16乙酸銨-甲酸乙腈溶液：移取10 mL乙酸銨溶液（5.12），5 mL甲酸（5.4），用乙腈（5.3）稀釋並定容至500 mL，混勻。
5.17標準儲備溶液（1 mg/mL）：準確稱取硫酸鏈黴素（CAS號： 3810-74-0，純度不低於99%）、硫酸雙氫鏈黴素（CAS號：5490-27-7，純度不低於97%）和單硫酸康黴素（CAS號： 25389-94-0，康黴素A純度不低於96%）標準品或對照品各10 mg（以有效成分計，精確至0.01 mg） ，分別於10 mL聚丙烯容量瓶中，用水溶解，定容，混勻。儲存於聚丙烯瓶中，2℃~8℃保存，有效期1個月。
5.18混合標準中間溶液（10 μg/mL）：準確移取硫酸鏈黴素、硫酸雙氫鏈黴素和單硫酸康黴素標準儲備溶液（5.17）1 mL於100 mL聚丙烯容量瓶中，用洗脫溶液（5.14）稀釋至刻度，混勻。儲存於聚丙烯瓶中，2℃~8℃保存，有效期1周。
5.19混合標準系列工作溶液：準確移取適量體積的混合標準中間溶液（5.18）於10mL聚丙烯容量瓶中，用洗脫溶液（5.14）稀釋配制成濃度分別為100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 0000 ng/mL、2 50ng/mL、5 000 ng/mL混合標準系列工作溶液。臨用現配。
5.20固相萃取小柱： 親水親脂（HLB）平衡型固相萃取柱，500 mg/6 mL 。
5.21尼龍微孔濾膜：0.22 μm。
6儀器裝置
6.1液相色譜-串聯質譜儀：配有電噴霧離子源。
6.2分析天平：精度0.1 mg和0.01 mg。
6.3渦旋混合器。
6.4超音波清洗器。
6.5離心機：轉速不低於 10 000 r/min。
6.6固相萃取裝置。
6.7氮吹儀。
6.8酸度計：精度 0. 01。
7樣品
按GB/T 20195的規客製備樣品，至少200g，粉碎使其全部透過0.425mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入密閉容器中，備用。選取與待測樣品型別相同，均勻一致，且在待測物保留時間處儀器響應值小於方法定量限30%的飼料樣品，作為基質空白樣品。
8試驗步驟
8.1提取
平行做2份試驗。稱取2 g（精確至0.1 mg）試樣於50 mL聚丙烯離心管中，準確加入30 mL混合提取溶液（5.10），渦旋混合1 min，超聲提取15 min，其間充分搖動2次，於10 000 r/min 離心10 min，準確移取15 mL上清液，用20%三氯乙酸溶液（5.9）調節pH至6.50±0.10，備用。
8.2 凈化
依次用5 mL甲醇（5.2）和5 mL水活化固相萃取小柱（5.20），將備用液（8.1）全部過柱，用5 mL水、5 mL 10%甲醇溶液（5.11）分別淋洗，真空負壓抽幹，準確移取5 mL洗脫溶液（5.14）進行洗脫，收集洗脫液，再次真空負壓抽幹，渦旋混合1 min，過微孔濾膜（5.21），待測。
8.3基質匹配標準系列溶液的制備
取基質空白試樣，按8.1和8.2處理得到空白基質溶液。準確移取混合標準系列工作溶液（5.19）各100 μL分別置於1.5 mL聚丙烯進樣瓶，用氮氣吹幹，準確加入1 mL空白基質溶液，渦旋混合30 s，配制成濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/ mL、250 ng/mL、500 ng/ mL的基質匹配標準系列溶液，待測。
8.4測定
8.4.1液相色譜參考條件
色譜柱： 醯胺柱，柱長100 mm，內徑2.1 mm，粒度1.7 μm ；或者效能相當者。
柱溫：35℃。
流速：0.3 mL/ min。
進樣量：4 μL。
流動相：A相為乙酸銨-甲酸溶液（5.15）；B相為乙酸銨-甲酸乙腈溶液（5.16）。
梯度洗脫：洗脫程式見表1。
8. 4.2質譜參考條件
游離方式：電噴霧游離，正離子模式（ESI+ ）。
檢測方式：多反應監測（MRM）。
噴霧電壓：5.5 kV。
霧化溫度：550℃。
多反應監測（MRM）離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2。
8.4.3基質匹配標準 系列溶液和試樣溶液測定
在儀器的最佳條件下，分別取基質匹配標準系列溶液（8.3）和試樣溶液（8.2）上機測定。基質匹配標準溶液的定量離子色譜圖見附錄A。
8.4.4 定性
在相同試驗條件下，試樣溶液與基質匹配標準系列溶液中待測物的保留時間相對偏差應在±2.5%之內。根據表2選擇的定性離子對，比較試樣譜圖中待測物定性離子的相對離子豐度與濃度接近的基質匹配標準系列溶液中對應的定性離子的相對離子豐度，若偏差不超過表3規定的範圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。
8.4.5 定量
以濃度為橫座標、色譜峰面積（響應值）為縱座標。繪制標準曲線。標準曲線的相關系數應不低於0.99。試樣溶液與基質匹配標準溶液申待測物的響應值均應在儀器檢測的線性範圍內。如超出線性範圍，應將試樣和基質空白樣品凈化（8.2）得到的溶液用洗脫溶液作同比例稀釋後，從「8. 3」開始按步驟重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測物的峰面積基質匹配標準溶液的峰面積相差不超過30%。
9試驗數據處理
試樣中鏈黴素、雙氫鏈黴素、康黴素A的含量以品質份數ωi計，單位為毫克每千克（mg/kg）。標準曲線校準按公式（1）計算；單點校推按公式（2）計算。
式中：
ρi——由基質匹配標準曲線得到的試樣溶液中待測物品質濃度的數值，單位為納克每毫升（ng/mL）；
V——混合提取溶液體積的數值單位為毫升（mL）；
V1——最終洗脫體積的數值單位為毫升（mL）；
n——試樣凈化液稀釋後的倍數；
V2——固相萃取凈化時備用液體積的數值，單位為毫升（mL）；
n——試樣品質的數值，單位為克（g）；
式中：
Ai——試樣溶液中待測物的色譜峰面積：
ρsi——基質匹配標準落液中待測物品質濃度的數值，單位為納克每毫升（ ng/mL）；
V——混合提取溶液體積的數值，單位為毫升（mL）；
V1——最終洗脫體積的數值，單位為（mL）；
n——試樣凈化液稀釋後的倍數；
V2——固相萃取凈化時備用液體積的數值， 單位為毫升（mL）；
Asi——基質匹配標準溶液中待測物的色譜峰面積；
m——試樣品質的數值，單位為克（g）。
測定結果以平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數位。
10 精密度
在重復性條件下，2次獨立測定結果與其算術平均值的絕對差值不大於該算術平均值的20%。
轉載自：http://www.xpl-hplc.com/en style/articleinfo_11804932.html
